许佳欢别亚男陈千晴陈柏羽欧宝芳谢水林吴少瑜*
(1.南方医科大学药学院,广州 510515;2.广东药科大学生命科学与生物制药学院,广州 511436;3.华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510006)
先兆子痫(pre-eclampsia,PE)是一种累及多器官的妊娠相关疾病,其发病机制是不同程度的胎盘灌注不良引起可溶性因子释放,导致母体血管内皮损伤,从而致使高血压和多器官功能障碍[1-2]。PE引起的胎盘损伤可导致胎儿生长受限、流产以及死胎死产。PE是孕产妇围产期死亡主要原因之一。2019年全球疾病负担报告显示,每年约有1800万妇女患有妊娠高血压疾病,约27 800名孕产妇死亡[3]。在过去的二十年中,先兆子痫的预防治疗取得了重大进展,主要包括孕前咨询、围产期血压控制和并发症管理、胎儿及时分娩和产后监测等[4]。但除分娩外,没有其他更有效的靶向性治疗方案,目前也缺乏特效药物延缓疾病进展。因此,建立PE动物模型,对揭示其相关分子机制和探索有效的靶向治疗方案提供理论和实验依据。
小鼠模型因与人类的高度同源性以及相似的循环系统,在PE研究中被广泛使用和接受[5]。模拟小鼠PE样症状的方法包括手术操作、近交系交配、外源性药物诱导以及构建转基因动物模型等[6]。其中外源性药物主要是通过干扰免疫系统从而诱导PE的发生。先天模式识别受体家族Toll样受体 (Toll-like receptors, TLR) 的激活会诱发妊娠依赖性高血压、肾功能不全、内皮功能障碍和胎盘损伤[7]。在本研究中,我们使用不同的TLR激动剂诱导PE,并评估TLR4激动剂脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)[8]和TLR7/8激动剂雷西莫特(Resiquimod, R848)[9]在构建PE模型方面的异同点。
1.1 实验动物
SPF级雄性CD-1小鼠12只,8～12周龄,体重30～40 g;SPF级雌性CD-1小鼠24只,8～12周龄,体重20～40 g;购于浙江维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(浙)2019-0001],饲养于广州华腾生物科技有限公司[SYXK(粤)2020-0237]。所有动物实验均经广州华腾生物科技有限公司伦理委员会审核并批准(HTSW211214),严格遵守3R原则。
1.2 主要试剂与仪器
脂多糖(上海麦克林生化科技有限公司,L861706);雷西莫特 (MedChemExpress,144875-48-9);小鼠ELISA试剂盒(soluble FMS-like tyrosine kinase 1, sFlt-1,ml002064; soluble endothelial factor, sEng,ml002193)(上海酶联生物科技有限公司);异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,R510-22)。大小鼠无创尾动脉血压测量分析系统(ZS-Z,北京众实科技有限公司);全自动生化分析仪(Thermo Indiko Plus)。
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组与造模处理
孕鼠的获得:将24只雌性小鼠与12只雄性小鼠按雌雄2∶1的比例合笼饲养过夜;在第2天9:00检查雌性小鼠的阴道栓,若见阴道栓定义为妊娠第0天(记为E0)。
动物分组与造模处理:将24只孕鼠随机分为4组:脂多糖对照组、脂多糖组、R848对照组、R848组,每组6只。脂多糖对照组于妊娠第13、14、15、16、17天(E13、E14、E15、E16、E17)尾静脉注射200 μL生理盐水;脂多糖组于妊娠第13、14、15、16、17天尾静脉注射40 μg/kg LPS;R848对照组于妊娠第13、15、17天腹腔注射200 μL R848溶剂(5% DMSO+40% PEG300+5% Tween-80+50% saline);R848组于妊娠第13、15、17天按10 mg/kg的剂量腹腔注射R848。
1.3.2 孕鼠无创血压测量
分别在妊娠第12、14、16、18天(E12、E14、E16、E18) 上午8:00～11:00,使用尾动脉血压监测仪测量孕鼠血压,每只孕鼠测量3次,结果取均值。
1.3.3 孕鼠尿蛋白/尿肌酐比值测定
收集孕鼠妊娠第17天17:00～妊娠第18天8:00的尿液,使用全自动生化分析仪测定尿蛋白与尿肌酐含量。
1.3.4 ELISA检测孕鼠血清sFlt-1和sEng水平
在妊娠第18天,采用眼眶静脉采血收集各组孕鼠血液于促凝管中,4℃静置30 min后,3000 r/min离心10 min收集上清。根据试剂盒说明书检测血清中sFlt-1和sEng的含量。
1.3.5 HE染色
在妊娠第18天,采用眼眶取血后,使用10 mL异氟烷过量麻醉处死孕鼠,开腹取出子宫,剥离胎盘,剖出胎鼠进行计数与称重。收集孕鼠的胎盘组织、子宫,于10%甲醛固定、乙醇脱水,经石蜡包埋、连续切片(厚度4 μm)后按常规步骤进行HE染色,观察各组织的病理改变。
1.4 统计学方法
实验数据采用IBM SPSS 20进行统计分析。采用GraphPad Prism 7软件进行绘图。对正态分布或近似正态分布的计量资料使用平均数±标准差(±s)进行统计描述。多组比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法或Tamhane’sT2法,P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组孕鼠尾动脉收缩压比较
于妊娠第13天开始给予相应药物后,LPS对照组与R848对照组相比,尾动脉收缩压水平无统计学差异(P＞0.05)。与LPS对照组相比,LPS组尾动脉收缩压水平显著升高(P＜0.0001)。与R848对照组相比,R848组尾动脉收缩压水平显著升高(P＜0.0001)(图1、表1)。LPS组和R848组均出现孕鼠妊娠期高血压。
表1 各组孕鼠尾动脉收缩压(mmHg, n=6)Table 1 The systolic blood pressure of the tail artery of pregnant mice in each group
图1 四组孕鼠妊娠第12、14、16、18天尾动脉收缩压(n=6)Figure 1 The systolic blood pressure of caudal artery of pregnant mice in four groups on the 12th, 14th, 16th and 18th day of pregnancy
2.2 各组孕鼠尿蛋白/尿肌酐比值比较
使用终点法测定孕鼠尿蛋白,氧化酶法测定孕鼠尿肌酐,求得比值后发现,与LPS对照组相比,LPS组比值升高(P＜0.05)。R848组与R848对照组无统计学差异(P＞0.05)(图2)。
图2 四组孕鼠尿蛋白/尿肌酐结果(n=6)Figure 2 Results of urinary protein/creatinine of pregnant mice in four groups
2.3 各组孕鼠胎鼠情况比较
经过统计分析(图3A),各组胎鼠数量无统计学差异(P＞0.05)(图3B)。LPS对照组与R848对照组胎鼠体重无统计学差异(P＞0.05),但与LPS对照组相比,LPS组的胎鼠体重略有下降(P＜0.05)。与R848对照组相比,R848组胎鼠体重显著下降(P＜0.0001)(图3C)。提示LPS和R848诱导的先兆子痫模型会影响胚胎的发育。
图3 四组孕鼠胎鼠大体观察、数量及体重结果(n=6)Figure 3 Results of gross observation, number and weight of pregnant mice in four groups
2.4 各组孕鼠血清中sFlt-1和sEng的表达量
ELISA检测结果显示(图4),与R848对照组相比,LPS对照组的各因子表达量无统计学差异(P＞0.05)。LPS组与LPS对照组相比,sFlt-1和sEng的表达无统计学差异(P＞0.05)。R848组相比较于R848对照组,sFlt-1和sEng的表达升高(P＜0.01)。
图4 各组孕鼠血清中sFlt-1和sEng的表达水平结果(n=3)Figure 4 Results of sFlt-1 and sEng expression level in serum of pregnant mice in four groups
2.5 病理学变化
HE染色结果显示(图5),LPS对照组和R848对照组的胎盘中迷路可见大量血窦,血窦大小正常,血窦周围见大量合胞体滋养层、细胞滋养层,细胞形态正常。LPS组胎盘组织与LPS对照组相比无明显差异。而R848组的全部孕鼠出现严重的胎盘病变:胎盘组织迷路可见大量蓝紫色钙盐沉积,合胞体滋养层广泛增生并伴有大量钙化,可见细胞灶状坏死,滋养层内血窦数量明显减少。
图5 四组孕鼠胎盘、子宫HE染色Figure 5 HE staining of placenta and uterus of four groups of pregnant mice
此外,子宫HE染色结果显示,LPS对照组和R848对照组子宫的黏膜层见大量绒毛样结构,上皮完整,上皮细胞胞质丰富,形态正常,固有层见较多毛细血管,管腔大小正常。与LPS对照组比较,LPS组2/3孕鼠的子宫的黏膜层绒毛轻度水肿,大量毛细血管增生及充血扩张,伴少量炎性细胞浸润。与R848对照组比较,R848组全部孕鼠的子宫的黏膜上皮高度水肿,绒毛明显增厚,固有层结缔组织增生明显,毛细血管增生及淤血扩张,组织内可见小范围轻度出血,伴少量炎性细胞浸润。
先兆子痫是一种多系统妊娠特异性疾病,其发病机制主要涉及两个阶段:胎盘异常和母体综合征的发展[10]。因此构建合适的动物模型有助于更好地了解其发病机制和寻找有效的治疗方法。小鼠胎盘在结构上类似于人类胎盘,具有高度的功能保护[11]。目前,构建小鼠PE模型的方法主要有:(1)使用手术诱导法,降低胎盘灌注压[12]。此方法产生类似于伴有胎儿生长受限的晚发性PE病理效应。由于手术是在胎盘发育后进行的,不影响螺旋动脉正常重塑,一般用于胎盘缺血和胎盘功能不全的研究;(2)近交系交配:雄性DBA/2近交系小鼠与CBA/J近亲繁殖[13], 此方法可引起半异体胎盘的免疫排斥反应,及主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)与母体不相容性导致流产;(3)基因编辑:storkhead box 1过表达[14]、吲哚胺2,3-双加氧酶敲除[15],此方法使用传统的转基因技术调控与PE相关基因的表达,同时影响胎盘和胎儿,因此必须考虑胎儿基因组改变对病理或表型的影响;(4)外源性药物诱导:血管紧张素II型1受体[16]、TLR激动剂[17]、L-NAME(ng-nitro-larginine methyl ester, 硝基-L-Arg-甲基酯)[18],这些药物中的绝大多数调节免疫系统,通常在胎盘发育发生后引入,模拟晚发性PE的慢性炎症状态;(5)全身性腺病毒感染和滋养层特异性转基因方法[19],全身性腺病毒感染因其肝中靶基因的腺病毒摄取和错误表达可导致母体假病毒性肝炎,产生与PE无关联性的其他症状。滋养层特异性慢病毒转基因方法仅在胎盘的滋养层部分表达靶基因,可避免产生脱靶或继发性效应。上述造模方法可产生PE部分或全部特征,及一些与人类PE临床不具相关性的辅助表型,但由于存在发病机制和功能活性的差异以及病理进程的不一致,仍需建立更可靠的PE动物模型进行验证以提高向人类转化效率。
LPS是一种细菌内毒素,作用于细胞膜表面的Toll样受体4[20]。LPS给药是常用的PE造模方法。在免疫细胞中,LPS可以触发促炎细胞因子的释放和活性氧的产生[21]。Li等[8]于妊娠7.5～17.5 d在CD-1小鼠中注射LPS,随后观察到血压升高,胎盘胎儿血管面积、滋养层侵袭和螺旋动脉重塑减少,纤维蛋白沉积和肾小球肿胀的肾损伤。
TLR7和TLR8通过与内体或吞噬体中的配体结合来识别细胞内信号[22]。与正常孕妇相比,PE患者的胎盘中合体滋养细胞和细胞滋养细胞中的TLR7和TLR8表达增加。研究发现,用TLR7/8激动剂诱导的PE小鼠,其滋养层细胞的TLR7和TLR8的蛋白质水平增加,出现高血压、蛋白尿、炎症和胎盘功能障碍的表征[9]。
在本研究中,与相对应的对照组相比,LPS模型组和R848模型组均出现了妊娠期高血压(收缩压≥140 mmHg/舒张压≥90 mmHg)。尿蛋白/尿肌酐结果显示,LPS组出现蛋白尿,但R848组并没有出现蛋白尿,这可能与TLR8在小鼠中抑制TLR7的介导作用有关,从而对肾有保护作用[23]。尽管如此,胎盘TLR7/8的过度激活可诱发妊娠依赖性高血压和内皮功能障碍。本研究发现,LPS组和R848组的胎儿体重低于相应对照组(P＜0.05),这表明胎儿生长受限。与此同时,HE染色结果表明,LPS组和R848组子宫均出现少量炎性细胞浸润,且R848组胎盘组织可见灶状坏死。因此,本研究成功地构建了使用TLR4激动剂LPS和TLR7/8激动剂R848诱导的PE动物模型。
在先兆子痫中,胎盘分泌的过量sFlt-1,通过结合局部和循环血液中的血管生成蛋白(vascular endothelial growth factor, VEGF)和胎盘生长因子(placental growth factor, PlGF),抑制其传导,从而导致内皮细胞功能障[24]。抗血管生成蛋白sEng是一种胎盘衍生的可溶性 转化生长因子β (transforming growth factor-β, TGF-β) 共受体,抑制TGF-β1与其受体和下游信号传导的结合,引起TGF-β信号传导失调[25]。sEng在先兆子痫患者血清中的表达量与疾病严重程度呈正相关。在妊娠大鼠中,相比于单独使用,sEng和sFlt-1的联用产生先兆子痫的体征和症状更严重[26]。这与我们的实验结果相一致,sEng和sFlt-1表达量升高的R848模型组比sEng和sFlt-1含量无统计学差异的的LPS模型组的先兆子痫表征更严重,如胎儿体重下降更明显、胎盘严重病变。
综上所述,LPS和R848均能构建出与人类PE病理相似(新发高血压或伴有蛋白尿、胎盘功能障碍以及其他器官功能障碍等[6])的PE动物模型。LPS在妊娠和非妊娠动物中都可诱导全身炎症,其机制为慢性炎症状态的持续激活,这表明LPS引起的表型可能不是妊娠特异性的[27]。根据胎盘HE染色结果表明,R848构建的PE模型表征更为严重,且给药方式为腹腔注射,操作简单。同时,在R848模型小鼠循环中发生了抗血管生成与促血管生成的不平衡:与对照组相比,R848组小鼠血清的sFlt-1和sEng表达上升,暗示TLR7/8介导的炎症免疫反应可能通过调节sFlt-1和sEng的表达从而抑制母胎界面的血管生成,参与PE的发生发展[28-29]。因此,针对TLR7/8开发的ssRNA或者小分子抑制剂可能通过促进新生血管的生成阻断PE的进展。
本研究建立的TLR7/8诱导的PE样小鼠模型是较为新颖且有相关数据支持的模型[30]。该模型不仅具有妊娠期特有的高血压以及合并胎儿生长受限等不良妊娠结局的PE样表型,而且具有类似人类PE胎盘滋养细胞侵袭不足的病理特征。进一步提示了母胎界面TLR7信号通路异常在PE发病过程中的重要作用,并为研究PE的发病机制提供了一个合适的动物模型。
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