曾鹏辉 窦 晨 高家菊 金 月 侯安国，3 马云淑,2*
1.云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500；
2.云南省高校外用给药系统与制剂技术重点实验室，云南 昆明 650500；
3.云南省彝医药与傣医药重点实验室，云南 昆明 650500
中药丁香(CaryophylliFols)来源于桃金娘科植物的干燥花蕾，具有温中降逆、温肾助阳等功效[1]；
肉桂(Cinnamomumcassia)来源于樟科植物肉桂的干燥树皮，具有散寒止痛、温经通脉等功效[2]。丁香、肉桂的配伍使用是在遵守中医药理论指导的前提下，通过长期中医临床应用实践总结出来的经典散寒止痛药对，临床上常用于各类治疗关节炎性病症的外用贴剂中配伍使用，如伤湿止痛膏、复方南星止痛膏、通络祛痛膏等。研究[3]表明，炎性病变在骨性关节炎的发病机理中起着非常重要的作用，软骨细胞、滑膜细胞以及浸润的免疫细胞释放的大量炎症因子，都会对关节的合成代谢和分解代谢过程产生影响。此外，炎症还会导致中性粒细胞的炎性浸润，对机体造成氧化损伤并产生大量自由基，进而加速软骨破坏[4]。
氧化应激在关节炎的发病过程中也起到相当重要的作用，活性氧类(ROS)的过量积累不仅会影响软骨细胞的合成代谢，加速软骨细胞衰老和凋亡，还会导致软骨基质结构发生改变从而丧失正常的生物功能，促进关节炎的发生[5-7]。综上所述，关节炎的形成发展与炎症及氧化应激有着密不可分的关系。
研究[8-9]表明，丁香中的丁香酚有良好的抗炎抗氧化作用，可降低细胞中多种炎症因子的释放，并有较好的清除自由基能力。肉桂的抗炎抗氧化作用主要体现在对炎症细胞因子、环氧化酶、免疫细胞及相关信号通路的调节[10]。丁香、肉桂的主要活性成分丁香酚、肉桂醛等均为挥发性成分[11]，本文采用GC-MS对丁香-肉桂药对混合提取的挥发油化学成分进行研究，探索药对挥发油抗氧化作用的物质基础，评价其抗氧化活性，为丁香-肉桂药对临床合理应用于关节炎病症及其作用机制分析提供实验依据。
1.1 材料 丁香、肉桂均购自昆明德阳远知中药饮片有限责任公司，经云南中医药大学中药学院张洁副教授鉴定为桃金娘科植物丁香的干燥花蕾和樟科植物肉桂的干燥树皮。DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液(PBS)均购买于美国BI公司；
脂多糖(LPS)、二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司；
MTT(货号G4000，美国Progema公司)；
乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；
抗坏血酸(VC)、过氧化氢、水杨酸钠、七水合硫酸亚铁、冰醋酸均为分析纯，购自广州光华科技股份有限公司；
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、三吡啶基三嗪(TPTZ)、2，2-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、硫酸铁、无水乙酸、三氯化铁，无水乙醇、30%过氧化氢、盐酸、水杨酸钠、无水乙酸钠均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，中国科学院上海细胞库。
1.2 仪器 Agilent 7890a-5975c气质联用仪(美国Agilent公司)；
酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；
4750E型CO2恒温培养箱(美国NUAIRE公司)；
PX822ZHE电子天平(d=0.01 g，奥豪斯仪器有限公司)；
10 L挥发油提取器(四川蜀玻有限公司)。
2.1 挥发油的提取与GC-MS分析 取丁香和肉桂饮片适量，将其粉碎后各称取200 g和600 g混合，加水量为6.4 L，浸泡8 h，回流提取6 h，收集上层的挥发油并加入无水硫酸钠，静置过夜以去除水分，离心得丁香-肉桂药对混合挥发油(丁香-肉桂挥发油)。取0.2 mL丁香-肉桂挥发油，用正己烷定容至10 mL并超声，过滤，备用。
气相色谱条件：安捷伦DB-5MS柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；
初始柱温为40 ℃(停留1 min)，先以10 ℃/min速率升温9 min至130 ℃并保持5 min，再以8 ℃/min速率升温15 min至250 ℃并保持5 min；
设定进样口端温度为280 ℃，所使用载气为高纯氦气，保持载气流量为1 mL/min；
采用分流进样模式，分流比10∶1，进样量1 μL；
设置溶剂延迟时间为4 min，总分离时间为35 min。
质谱条件：电离轰击方式为EI，电子能量调整为70 eV，设定离子源温度230 ℃，质谱端温度250 ℃，质量扫描范围：m/z 50～600。
2.2 ABTS+自由基清除能力的测定 参考文献[12]的方法并稍作改进，将7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L的过硫酸钾混合，黑暗处静置12 h，用无水乙醇稀释生成的ABTS+溶液，使其在30 ℃，734 nm波长下的吸光度为(0.7±0.02)，即得到ABTS+工作液。取150 μL的ABTS+溶液加入50 μL不同浓度样品液，空白组用甲醇代替样品溶液，对照管用蒸馏水代替ABTS+工作液，重复试验3次，室温避光放置30 min，于波长734 nm下测定其吸光度。
2.3 DPPH自由基清除能力的测定 参考文献[13]的方法并稍作改进，配制0.2 mmol/L DPPH工作液，取100 μL的DPPH溶液加入同体积不同浓度样品液，空白组用甲醇代替样品溶液，对照管用甲醇代替DPPH工作液，重复试验3次，室温避光放置30 min，于波长517 nm下测定其吸光度。
2.4 总还原力FRAP法测定 参考文献[14]的方法并稍作改进，配置FRAP工作液，将300 mmol/L的醋酸盐缓冲液，10 mmol/L-TPTZ和20 mmol/L的FeCl3按照10∶1∶1的比例混匀，37 ℃水浴30 min，现配现用。195 μL的FRAP试剂和5 μL不同的样品液37 ℃孵育6 min，重复试验3次，室温避光放置30 min，于波长593 nm下测定其吸光度。
2.5 挥发油细胞毒性试验 将RAW264.7细胞按5.0×104个/孔接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。弃去上清，实验组加入不同浓度样品溶液处理细胞；
对照组细胞加入完全培养基。培养24 h后，每孔加20 μL的MTT溶液，置于恒温箱中继续培养4 h。弃去上清液后再加入150 μL二甲基亚砜，振荡溶解10 min。492 nm下测定吸光值。
2.6 H2O2诱导巨噬细胞氧化损伤模型 将RAW264.7细胞按5.0×104个/孔接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。弃去培养基，进行分组处理，对照组加入含0.1% DMSO的完全培养基，实验组分别加入不同浓度的H2O2溶液，孵育8 h。采用MTT法检测吸光度，操作同2.5。
2.7 丁香-肉桂挥发油对H2O2诱导的RAW264.7细胞存活率影响 取RAW264.7细胞按5.0×104/孔的细胞浓度接种在96孔板中，置于5%CO2、37 ℃的恒温培养箱中培养24 h。弃去培养基，进行分组处理，对照组加入含0.1% DMSO的完全培养基，实验组分别加入不同浓度的丁香-肉桂挥发油溶液，每组6个复孔，24 h后全部组加入H2O2溶液孵育8 h。采用MTT法检测吸光度，操作同2.5。
2.7 氧化因子测定 将RAW264.7巨噬细胞按照每孔4.0×105个的细胞浓度接种在6孔板中(每孔加入2 mL)，孵育24 h。去除培养基，对照组和模型组加入含0.1% DMSO的完全培养基，实验组加入含有不同浓度挥发油的培养基孵育24 h，然后模型组和实验组更换为含600 μmol/L H2O2的培养基处理8 h，对照组更换为完全培养基。按照试剂盒说明书要求收集培养基上清液或者细胞蛋白用于测定SOD、CAT、LDH和GSH的含量。
3.1 GC-MS分析 如图1所示，丁香-肉桂挥发油通过GC-MS检测到了22种成分，依据NIST质谱数据库检索分析鉴定出20种挥发性成分，其峰面积之和占总峰面积的97.88%。其中丁香酚、α-古巴烯、β-石竹烯、肉桂醛这四种成分相对含量较高。具体成分信息见表1。
表1 丁香-肉桂挥发油的成分表
表1(续)
图1 丁香-肉桂挥发油总离子流图
3.2 ABTS+法 如图2所示，当丁香-肉桂挥发油浓度从6.25 μg/mL增加到50 μg/mL，对ABTS+自由基的清除率从4.81%增加到85.12%，后趋于稳定，其IC50为(24.15±1.03)μg/mL。随着挥发油浓度的增加，其对ABTS+自由基的清除率也随之增加，表明丁香-肉桂挥发油对ABTS+自由基有较好的清除作用，其抗氧化作用在低浓度时弱于维生素C(VC)，高浓度时相当。
图2 丁香-肉桂挥发油对ABTS+自由基的清除率图
3.3 DPPH法 如图3所示，随着丁香-肉桂挥发油浓度的增加，其对DPPH自由基的清除率也随之增加，当丁香-肉桂挥发油浓度从6.25 μg/mL增加到100 μg/mL，对DPPH自由基的清除率从5.11%增加到78.82%，其IC50为(47.23±1.89)μg/mL，表明丁香-肉桂挥发油对DPPH自由基有一定的清除作用，但抗氧化作用弱于VC。
图3 丁香-肉桂挥发油对DPPH自由基的清除率图
3.4 FRAP法 抗氧化剂可以通过提供单个电子的可以使Fe3+-TPTZ配合物还原成蓝色的Fe2+-TPTZ配合物，因此可以从吸光度值来判断抗氧化剂的总抗氧化能力[15]。如图4所示，总抗氧化能力与丁香-肉桂挥发油浓度呈现量效关系，丁香-肉桂挥发油具有一定的抗氧化能力，但其总抗氧化能力弱于VC。
图4 丁香-肉桂挥发油的总抗氧化能力图
3.5 丁香-肉桂挥发油对RAW264.7细胞的存活率检测 如图5所示，20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL丁香-肉桂挥发油对RAW264.7细胞的细胞活力具有较好的维持作用，分别达到95.73%、96.89%、92.77%；
120 μg/mL丁香-肉桂挥发油给药组细胞活力为69.14%，因此本实验选择给药剂量为20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL。结果表明，0～80 μg/mL丁香-肉桂挥发油对RAW264.7细胞没有毒性。
图5 丁香-肉桂挥发油对RAW264.7细胞的存活率检测图
3.6 H2O2造模实验 如图6所示，使用H2O2刺激细胞后会使细胞的存活率下降，且随着浓度增大，其对细胞的杀伤力越大。当H2O2浓度为600 μmol/L时，此时细胞存活率接近一半。因此后续实验选择600 μmol/L的H2O2刺激RAW264.7细胞产生氧化损伤模型。
图6 H2O2对RAW264.7细胞存活率的影响图
3.7 给药后存活率检测 丁香-肉桂挥发油对对氧化损伤模型细胞的存活率如图7所示，与正常组相比，模型组细胞的存活率显著降低；
与模型组相比，不同浓度的丁香-肉桂挥发油组细胞存活率较模型组分别提高。表明丁香-肉桂挥发油可减少因H2O2刺激而引起的细胞死亡。
图7 丁香-肉桂挥发油对氧化损伤模型细胞的存活率图
3.8 氧化因子测定 乳酸脱氢酶(LDH)是葡萄糖酵解所必需的酶，LDH不仅可将葡萄糖催化脱氢为丙酮酸，还可进一步将丙酮酸还原为乳酸，故LDH活性与巨噬细胞激活程度相关，是巨噬细胞激活的标志之一[16]。由图8可知，模型组与对照组相比，细胞内的LDH水平显著升高(P<0.01)；
药物组与模型组相比，丁香-肉桂挥发油各剂量组均能显著降低巨噬细胞LDH活性(P<0.05)，且浓度越高，效果越好，呈现明显的量效关系。
图8 丁香-肉桂挥发油对H2O2诱导的巨噬细胞内LDH含量的影响图
谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽，具有抗凋亡、抗炎、促进组织修复、清除自由基等多种重要生理功能[17-18]。由图9可知，模型组与对照组相比，细胞内的GSH水平显著降低(P<0.01)；
药物组与模型组相比，丁香-肉桂挥发油各剂量组均能显著提高巨噬细胞GSH活性(P<0.05)，且浓度越高，效果越好，呈现明显的量效关系。
图9 丁香-肉桂挥发油对H2O2诱导的巨噬细胞内GSH含量的影响图
丙二醛(MDA)含量是反映机体抗氧化潜在能力的重要参数，MDA含量升高引发生物膜中的多不饱和脂肪酸发生氧化反应，并且其分解产物会引起细胞损伤，改变细胞膜构型、结构和通透性进而诱导氧化应激[19]。由图10可知，模型组与对照组相比，细胞内的MDA水平显著提高(P<0.01)；
与模型组相比，丁香-肉桂挥发油各剂量组均能显著降低巨噬细胞MDA活性(P<0.05)，且浓度越高，效果越好，呈现明显的量效关系。
图10 丁香-肉桂挥发油对H2O2诱导的巨噬细胞内SOD含量的影响图
超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内的一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用[20]。由图11可知，模型组与对照组相比，细胞内的SOD水平显著降低(P<0.01)；
与模型组相比，丁香-肉桂挥发油各剂量组均能显著提高巨噬细胞SOD活性(P<0.05)，且浓度越高，效果越好，呈现明显的量效关系。
图11 丁香-肉桂挥发油对H2O2诱导的巨噬细胞内MDA含量的影响图
在正常情况下，需氧生物通过组织良好的酶和非酶的自我防御系统来维持细胞稳态[21]。当机体内氧自由基主要是ROS的过度表达，会使细胞受损，最终导致多种疾病的发生[22]。巨噬细胞不仅参与宿主防御，有识别和清除微生物病原体的功能，同时也是ROS等促氧化剂作用的主要靶点[23]。因巨噬细胞易受ROS影响且在免疫系统中非常重要，故研究多采用巨噬细胞作为氧化损伤模型[24-26]。
研究结果显示，丁香-肉桂挥发油对ABTS+自由基和DPPH自由基都有较好的清除作用，其总抗氧化能力与丁香-肉桂挥发油浓度呈现量效关系；
且能显著提高经H2O2诱导损伤后的RAW264.7细胞存活率；
细胞中SOD和GSH活性明显提高，同时MDA和LDH含量显著降低。因此丁香-肉桂挥发油是通过提高抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化酶反应的活性来达到抗氧化的作用效果。
据文献[27]报道，丁香挥发油中相对含量较高的成分有丁香酚、β-石竹烯、乙酸丁香酚酯和α-古巴烯等。肉桂挥发油中肉桂醛、α-古巴烯、α-蒎稀、β-蒎稀、α-依兰油烯等的成分含量较高[28]。结合GC-MS分析结果可知，文献[29-30]报道的丁香、肉桂各自挥发油中含量最高的几个成分，在二者混合提取时均有出现，其中β-石竹烯、α-古巴烯等成分在挥发油中的相对含量较高，且有研究发现其单体成分均具有良好的抗氧化作用。有待进一步研究验证丁香-肉桂挥发油发挥抗氧化作用是否主要与β-石竹烯、α-古巴烯等有关。
本文初步探究丁香-肉桂挥发油的体外抗氧化活性和对氧化损伤细胞的保护作用，为丁香-肉桂的联合抗氧化应用与抗骨关节炎提供了一定的依据，但该药对配方应用对其抗骨关节炎与抗氧化作用的物质基础与作用机制尚需开展进一步相关动物、细胞分子生物学等实验研究，为该药对在临床合理应用提供理论基础。
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