王超，付瑞嘉，左倩，徐顶巧，乐世俊，唐于平（陕西中医药大学 陕西省中医药管理局中药配伍重点研究室，西安 712046）
急性肝脏损伤（acute liver injury，ALI）可由多种因素诱发，包括酒精、药物滥用、病毒感染、代谢和自身免疫攻击[1-2]。ALI发展末期会演变成肝纤维化或肝硬化，治疗难度高，治疗费用昂贵，故对肝脏疾病的早期防治十分重要。研究表明，肝损伤的病理过程中伴随着大量的炎症和氧化应激反应，抑制炎症以及缓解氧化应激反应对于治疗肝损伤具有重要意义[3]。因此，具有抗炎和抗氧化活性的药物可用于治疗肝损伤。蓍草来源于菊科植物蓍Achillea alpinaL.的干燥地上部分，具有解毒利湿、活血化瘀的功效[4]。现代研究表明，蓍草具有抗炎[5]、抗氧化、抗菌[6]的作用，能够显著改善高血压[7]、肝损伤[8]等疾病。蓍草治疗肝损伤的药效确切[9-10]，但是缺乏药效物质基础和作用机制的研究。网络药理学是基于系统生物学和药理学的综合性学科，通过分析生物网络和生物功能，从而系统化阐明药物分子作用机制。故本研究基于UPLC-Q-TOF/MS分析鉴定蓍草中含有的成分，然后利用网络药理学筛选预测这些成分作用的靶点并结合动物实验对网络药理学分析结果进行验证，进而初步探究蓍草防治ALI的药效及作用机制，以期为临床治疗ALI提供指导。
1.1 动物
SPF级SD雄性大鼠24只，体质量（200±20）g [成都达硕实验动物有限公司，合格证号SCXK（川）2020-030]，动物实验经陕西中医药大学伦理委员会批准，动物饲养和实验操作均符合实验管理条例要求。
1.2 试药
蓍草购自铜陵禾田中药饮片股份有限公司，药材经陕西中医药大学颜永刚教授鉴定为菊科植物蓍Achillea alpinaL.的干燥地上部分；
联苯双酯滴丸（万邦德制药集团有限公司，规格：1.5 mg，批号：19J210318）。四氯化碳（CCl4，天津市天力化学试剂有限公司，批号：20210902），橄榄油（上海源叶生物科技有限公司，批号：H29O11P129145），LC-MS级甲醇（Honeywell Burdick & Jackson 公司），LC-MS级甲酸（德国Darmstadt 默克公司），分析纯甲醇（天津天利化学试剂有限公司），二甲苯、正丁醇、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），柠檬酸抗原修复液、环保型脱蜡透明液、PBS缓冲液（武汉赛维尔科技有限公司）；
谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；
BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；
大鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、IL-1β酶联免疫试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；
一抗TLR-4、NF-κBp65、Nfr2、keap1、HO-1以及二抗辣根 HRP 标记山羊抗兔IgG 抗体（武汉赛维尔科技有限公司）。
1.3 仪器
Waters ACQUITY Ⅰ-Class UPLC、Waters SYNAPT G2-Si Q-TOF 高分辨率飞行时间质谱仪（美国Waters公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司），RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），多功能酶标仪（美国基因生物科技有限公司），Centrifuge 5418R台式离心机、恒温板式混匀仪（德国Eppendorf公司），Donatello脱水机（米兰DIAPATH公司），JB-P5包埋机（武汉俊杰电子有限公司），RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司），DHG-9140A烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司）。
2.1 UPLC-Q-TOF/MS 检测蓍草的成分
2.1.1 样品制备 取蓍草药材（过2号筛）约2 g，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇40 mL，密塞，称重，40℃水浴，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）45 min，放冷，再次称重，用70%甲醇补足损失量，摇匀，抽滤，取续滤液，即得蓍草提取液。取蓍草提取液以适量甲醇稀释，5000 r·min-1离心5 min，取上清过0.22 μm微孔滤膜得供试品溶液。
2.1.2 色谱条件 Waters Acquity BEH C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温35℃；
流动相为0.1%甲酸水（A）-纯甲醇（B），梯度洗脱：0～1 min，90%A；
1～5 min，90%→65%A；
5～7 min，65%→60%A；
7～10 min，60%→30%A；
10～11 min，30%→15%A；
11～11.5 min，15%→5%A；
11.5～12 min，5%A。流速0.3 mL·min-1，检测波长290 nm，进样量5 μL。
2.1.3 质谱条件 ESI源条件：负离子模式，毛细管电压2.5 kV，样品锥孔温度55℃，源温度120℃，脱溶剂气温度280℃，锥孔气体流量50 L·h-1，氮气作为雾化气（600 L·h-1），扫描模式为全扫描，扫描范围m/z100～1200 Da。采用MassLynx v4.2软件处理数据。
2.2 网络药理学
2.2.1 关键靶点的筛选 将UPLC-Q-TOF/MS检测到的成分英文名输入TCMSP数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）和CTD数据库（http：//ctdbase.org/）获取作用靶点。对于靶点较少或检索不到作用靶点的成分，使用PubChem数据库查询获取成分的Canonical SMILES 号，将SMILES号上传至Similarity Ensemble Approach数据库（http：//sea.bkslab.org/）和Swiss Target Prediction平台（http：//www.swisstargetprediction.ch/），预测这些成分可能作用的靶标点。以“acute liver injury”或“acute hepatic damage”为关键词，在OMIM（https：//www.omim.org/），GeneCards（https：//www.genecards.org/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中检索，合并并去掉重复靶点，得到ALI疾病相关作用靶点。最后，使用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）将所有靶点名称标准化。将蓍草成分的作用靶点与疾病靶点取交集并将交集靶点导入Venn平台绘图，获得蓍草防治ALI的关键靶点。将蓍草成分与关键靶点导入Cytoscape 3.8.2软件构建蓍草“成分-靶点-疾病”网络关系图并分析。
2.2.2 靶点蛋白互作（PPI）网络分析 将交集靶点导入STRING （https：//string-db.org/）数据库，构建PPI网络，限定物种为“Homo sapiens”，蛋白互作评分设定为最低不小于0.4，删除与其他蛋白无相互作用的蛋白，将结果保存为“TSV”格式文件并导入Cytoscape 3.8.2软件进行网络拓扑分析，以各个节点的连接度（Degree），介度（Betweenness）及紧密度（Closeness）均大于其中位数为筛选条件筛选核心靶点。
2.2.3 GO功能及KEGG通路富集分析 将交集靶点输入DAVID （https：//david.ncifcrf.gov/）数据库中，设置物种为“Homo sapiens”，进行GO功能富集分析及KEGG通路分析。
2.3 动物实验
2.3.1 蓍草提取液的制备 蓍草经打粉机粉碎后过2号筛，称取150 g蓍草粉末置于2 L圆底烧瓶中，加入6倍量50%乙醇，40℃水浴250 W超声提取45 min，抽滤，药渣置于1 L圆底烧瓶中，加入3倍量50%乙醇，40℃水浴250 W超声提取45 min，合并2次滤液，使用旋转蒸发仪回收乙醇，浓缩药液。本次实验共提取蓍草600 g，按上述提取方法，分4次提取，最终合并4次浓缩药液，超纯水定容至400 mL，制备得到1.5 g·mL-1的蓍草提取液。
2.3.2 阳性药配制方法 取联苯双酯滴丸10粒于研钵中碾碎成粉末，于40 mL纯水中超声溶解，得0.375 mg·mL-1的阳性药溶液。
2.3.3 动物分组及给药 24只大鼠适应性饲养一周后，按照正常组、模型组、蓍草组、阳性药组随机分为4组，每组6只，适应性饲养一周后，开始给药。蓍草组按蓍草生药量15 g·kg-1的剂量灌胃给药，一日一次，连续两周。阳性药组使用3.75 mg·kg-1联苯双酯滴丸溶液灌胃给药，一日一次，连续两周。正常组和模型组给予纯水同体积灌胃。末次给药4 h后，除正常组外，其余各组均腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液2 mL·kg-1，正常组腹腔注射同体积橄榄油溶液，大鼠禁食不禁水12 h，乌拉坦麻醉后，腹主动脉采血，摘取肝脏。
2.3.4 脏器指数及生化指标的测定 取肝脏用冷生理盐水冲洗干净，用滤纸擦干，称重并计算肝指数。肝指数（%）＝（肝重/体重）×100%。血液静置0.5 h后，以3000 r·min-1离心15 min，取上清液，按照试剂盒说明书，检测分组大鼠血清中ALT和AST水平。精密称取肝脏组织，加入适量生理盐水，4℃研磨成10%肝匀浆，以12 000 r·min-1离心5 min，取上清液检测MDA、CAT和SOD活性水平；
按照ELISA试剂盒操作检测大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。
2.3.5 肝脏组织病理学形态变化 剪取各组大鼠肝脏同一部位组织于10%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋切片，进行HE染色后200倍物镜下观察病理状态。
2.3.6 肝脏中TLR-4、NF-κBp65、Nfr2、keap1、HO-1蛋白表达的检测 肝脏组织切片，常规脱蜡至水，使用柠檬酸缓冲液进行抗原修复，双氧水灭活，BSA室温封闭；
加一抗[TLR-4 （1∶400）、NF-κBp65 （1∶600）、Nfr2 （1∶600）、keap1（1∶800）、HO-1 （1∶800）]4℃过夜；
PBS冲洗，二抗孵育，DAB显色后苏木素复染，自来水冲洗，苏木素返蓝，流水冲洗，脱水封片后镜检，阳性为棕黄色。
2.3.7 统计学分析 数据均以±s表示，采用GraPhpad Prime 8进行统计学分析。各组间的比较均采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
3.1 蓍草UPLC-Q-TOF-MS检测结果
运用 UPLC-Q-TOF-MS/MS 得到的蓍草鉴定图谱，见图 1。使用 UNIFI 数据处理系统、Masslynx v4.2 软件和查阅文献比对，共鉴定出 20种化合物，见表 1。
表1 蓍草UPLC-Q-TOF/MS鉴定成分Tab 1 Components identified by UPLC-Q-TOF/MS of Achillea alpina L.
图1 蓍草提取液负离子BPI模式图Fig 1 BPI pattern of negative ions of Achillea alpina L. extract
3.2 网络药理学结果
3.2.1 蓍草防治ALI的“成分-靶点-疾病”网络
通过数据库检索得到20个成分作用的潜在靶点共316个。从OMIM、GeneCards和NCBI数据库中共检索到ALI相关靶点共19 033个。将蓍草成分的作用靶点与疾病靶点取交集共得到291个关键靶点。将蓍草的成分和关键靶点导入Cytoscape 3.8.2软件构建蓍草“成分-靶点”网络关系图并进行拓扑分析，见图2。根据度值进行筛选，排名前十的成分分别为异栎素、蓍素、绿原酸、芒柄花素、双酚A、百蕊草素Ⅱ、3，4，5-tetracaffeoylquinic acid、kaempferol 3-O-（6""-caffeoyl）-β-D-glucopyranoside、quercetin 3-O-（6""-caffeoyl）-β-D-glucopyranoside、艾黄素，这些成分可能是蓍草预防治疗ALI的活性成分。
图2 “成分-靶点”网络图Fig 2 “Component-target” network diagram
3.2.2 核心靶点PPI网络 共得到104个核心靶点，见图3。可以认为是蓍草防治ALI的核心靶点，其中节点越大，颜色越深，表明度值越大。
图3 核心靶点PPI网络图Fig 3 Core target PPI network diagram
3.2.3 生物信息学分析 选取P＜0.05，GO功能排名前十，KEGG通路排名前二十的结果进行可视化，见图4。GO生物富集结果中，生物过程（biological process，BP）主要涉及炎症反应、凋亡及缺氧反应等；
细胞组分 （cellular component，CC）主要涉及质膜、浆膜及细胞外区等；
分子功能 （molecular function，MF）主要涉及氧化还原酶活性以及蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析显示，主要涉及IL-17信号通路、TNF信号通路及Toll样受体信号通路等。综上Toll样信号通路与ALI关系紧密，故选择通过动物实验对该通路进行验证。
图4 生物信息富集图Fig 4 Bioinformation enrichment map
3.3 动物实验研究
3.3.1 蓍草提取液对ALI大鼠的肝指数的影响 与正常组（N组）对比，模型组（M组）肝指数增大，血清ALT、AST水平显著上升。与模型组相比，阳性药组（P组）肝指数显著降低，血清中ALT、AST水平显著下降；
蓍草给药组（S组）肝指数显著降低，血清中ALT、AST水平显著下降，结果见图5。
图5 蓍草提取液对四氯化碳诱导的急性肝损伤大鼠肝指数及肝功能影响（ ±s，n＝6）Fig 5 Effect of Achillea alpina L. extract on liver index and liver function in rats with acute liver injury induced by Carbon tetrachloride（x± s，n＝6）
3.3.2 蓍草对大鼠肝脏氧化应激指标的影响 与正常组比较，模型组MDA含量增加，SOD和CAT活力明显降低。与模型组比较，阳性药组MDA含量显著降低，SOD和CAT活力明显增加；
蓍草给药组MDA含量显著降低，SOD和CAT活力明显增加，结果见图6。
图6 蓍草提取液对四氯化碳诱导的急性肝损伤大鼠抗氧化能力的影响（ ±s，n＝6）Fig 6 Effect of Achillea alpina L. extract on the antioxidant capacity of rats with acute liver injury induced by Carbon tetrachloride（ ±s，n＝6）
3.3.3 蓍草对大鼠血清炎症因子的影响 与正常组比较，模型组TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著升高。与模型组比较，阳性药组TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著降低；
蓍草给药组TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著降低，结果见图7。
图7 蓍草提取液对四氯化碳诱导的急性肝损伤大鼠抗炎能力的影响（ ±s，n＝6）Fig 7 Effect of Achillea alpina L. extract on anti-inflammatory ability of rats with acute liver injury induced by Carbon tetrachloride（ ±s，n＝6）
3.3.4 蓍草对大鼠肝组织形态的影响 正常大鼠肝脏颜色红润，表面光滑有光泽，质地柔软；
四氯化碳诱导损伤的大鼠肝脏颜色暗红，大叶与小叶间有白色粘连，光泽度下降，被膜下游黄白色颗粒；
联苯双酯组与蓍草给药组的病理变化相对较轻。
正常大鼠肝脏组织结构正常，肝细胞呈索状排列，各肝细胞间界限清晰。四氯化碳诱导损伤的大鼠肝脏细胞水肿严重，细胞排列紊乱，界限模糊，存在较多坏死细胞，炎症浸润明显。联苯双酯组和蓍草给药组大鼠肝细胞损伤程度较轻，存在有少量肝细胞水肿、坏死及炎症浸润。结果见图8。
图8 蓍草对急性肝损伤大鼠肝脏组织病理变化的影响Fig 8 Effect of Achillea alpina L. on histopathological changes in the liver of rats with acute liver injury
3.3.5 相关蛋白免疫组化染色结果 蓍草对四氯化碳诱导的ALI大鼠肝组织相关蛋白的影响如图9所示，各蛋白在细胞质中阳性表达，棕黄色的深浅代表蛋白表达量的多少。结果表明，TLR-4、NF-κBp65、HO-1和keap1在正常大鼠肝组织中仅少量表达，模型组中四者表达量上升。相较于模型组，在使用蓍草和联苯双酯给药后，TLR-4、NF-κBp65 和keap1表达量降低，HO-1在蓍草组中表达量降低，在阳性药组表达上升。Nfr2在正常大鼠肝组织中表达量较高，在模型组中表达降低，经蓍草和联苯双酯给药后的大鼠肝组织中Nfr2表达上升。
图9 各蛋白免疫组化结果（×200）Fig 9 Immunohistochemical results for each protein （×200）
ALI是指由多种原因引起的肝脏损伤的疾病总称，具有发病急、易复发、风险大等特点。肝脏作为体内最大的代谢器官，药物的代谢多在肝脏中完成，而目前临床保肝药物需要长时间服药且伴有许多不良反应，这无疑加大了肝损伤的风险[11]。故寻找安全有效的治疗方法是当前肝损伤临床研究的重点问题。目前，中医药防治肝损伤被认为是较好的方法，但中医药防治肝损伤的作用机制研究尚不明朗。
本研究通过 UPLC-Q-TOF/MS检测蓍草中的主要化学成分，共鉴定出 20 种成分。通过网络数据库筛选，最终选出104个核心靶点，包括 TNF、IL-6、ALB、TLR4、NFKBIA等。然后，进一步构建“成分-靶点-疾病”网络，根据度值筛选出异栎素、蓍素和绿原酸等10个成分。有研究表明异栎素具有保肝退黄的作用[12]，能够激活p38蛋白，促进Nrf2的上调，TLR、NF-κB和HO-1的下调，从而减少炎症反应，增强抗氧化效果[13]。绿原酸具有良好的抗炎和抗氧化活性[14]，研究表明其可以通过调节Toll样受体信号通路缓解ALI[15]。TNF、IL-6和ALB等均为体内炎症信号传导因子，在体内炎症反应中大量存在，研究表明三者均参与ALI的发病过程[16]。由此表明蓍草可能通过异栎素、绿原酸等活性成分通过作用于TNF、TLR4等核心靶点发挥预防治疗ALI的作用。
GO功能富集分析表明，蓍草中活性成分可能通过质体膜、细胞膜和细胞质等细胞组分参与炎症反应的正向调节、对缺氧的反应和凋亡过程的负调控等生物学过程，发挥酶结合、血红素结合和蛋白磷酸酶结合等分子功能达到治疗ALI的目的。KEGG 富集分析发现，蓍草治疗ALI的 104 个核心靶点主要参与 Toll样受体、IL-17、TNF 等信号通路。有文献报道，肝损伤中肝细胞死亡受体和识别受体受到刺激，Toll样受体会被识别激活，诱导NLRP3炎症小体生成，从而导致肝细胞焦亡，可见Toll样信号通路与ALI关系紧密[17]，故本研究选择对该通路进行验证。
使用四氯化碳诱导ALI是一种经典的ALI模型，常被用于筛选治疗肝损伤的药物中[18]。在本研究中，模型组大鼠AST、ALT以及肝指数水平显著上升，肝细胞水肿严重，且存在肝细胞坏死，表明ALI模型造模成功。在给予蓍草提取液的大鼠中，ALT、AST以及肝指数水平显著降低，肝细胞损伤程度有所缓解，表明蓍草对ALI大鼠的肝脏具有一定的保护作用。
研究表明，肝损伤的病理过程中伴随着严重的氧化应激和炎症反应[19]。四氯化碳引起肝细胞损伤后，肝脏内会产生脂质过氧化反应，产生大量过氧化物损伤肝细胞，如MDA[20]。为了防御这些物质带来的损伤，肝脏内会产生SOD和CAT发挥抗氧化作用[21]。本研究发现，相较于模型组，蓍草给药组可以降低肝脏组织中MDA的含量和血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平，提高SOD和CAT的活性。结果表明蓍草可以通过降低肝脏的氧化应激和炎症反应保护ALI大鼠的肝脏。研究表明，细胞可以通过转录因子上调特定抗氧化剂以及抗氧化酶的合成，而主要被调节的转录因子为Nrf2[22-23]。keap1/Nrf2轴是细胞内氧化还原平衡的主要调节因子，而keap1/Nrf2/HO-1信号通路是体内维持细胞氧化还原稳态，调节炎症和解除细胞毒性的重要途径。当体内产生氧化应激反应时，Nrf2会从keap1中解离，转入细胞核，并与转录因子结合产生复合物，复合物会与抗氧化反应元件结合，促进HO-1抗氧化基因的转录[24-25]。Toll样受体信号通路与炎症因子的调控和释放密切相关，其激活后会合成大量TNF家族的炎症因子。研究表明，TLR4属于Toll样信号通路上游信号分子，在肝细胞中广泛存在，通过与各种病原微生物分子结合后激活，传递信号促使下游信号分子MyD88磷酸化，MyD88磷酸化激活后可以激活下游NF-κB分子的磷酸化，从而控制促炎因子和一些免疫相关基因的表达[26]。故本研究选择采用免疫组化检测Nrf2、keap1、HO-1、TLR4和NFKBIA蛋白的表达，验证keap1/Nrf2/HO-1和Toll样受体信号通路，探究蓍草预防治疗ALI的作用机制。研究结果显示，蓍草可以提高Nrf2蛋白的表达，降低keap1、HO-1、TLR4和NFκBp65蛋白的表达，表明蓍草预保护治疗ALI的机制可能与调控keap1/Nrf2/HO-1和Toll样受体信号通路有关。
综上所述，本研究通过 UPLC-Q-TOF/MS 联合网络药理学的方法，阐明了蓍草中的活性成分、靶点、通路之间的相互作用关系，并通过动物实验对网络药理学的分析结果进一步验证，发现蓍草治疗ALI的作用与调节keap1/Nrf2/HO-1和Toll样受体信号通路密切相关，这可为后续临床中治疗ALI提供指导。
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