拜礼文，焦兴苹，谭金华，肖华，海平*，张炜*（1. 青海大学医学院，西宁 810016；
. 青海省药品检验检测院/青海省中藏药现代化研究重点试验室/国家药品监督管理局中药（藏药）质量控制重点试验室，西宁 810016）
石榴健胃制剂（包括石榴健胃丸、石榴健胃散、石榴健胃片，以下同）由石榴子、肉桂、豆蔻、荜茇及红花组成，处方源自《四部医典》[1]，对于治疗肠易激综合征[2]、功能性消化不良[3]、炎症性肠病[4]及小儿再发性腹痛[5]等疾病有较好的疗效。处方中豆蔻、肉桂、荜茇均含有挥发性成分[6-14]，其中桉油精具有抗炎、抗氧化、镇痛、神经保护等作用[15]；
桂皮醛具有抗炎、抗肿瘤、抗菌等作用[16]；
胡椒碱具有镇痛、抗炎、解痉等作用[17]。
目前，全国生产石榴健胃丸（片、散）的藏药生产厂家有8家，对于石榴健胃制剂的定性和定量分析，各现行标准参差不齐，难以全面评价该制剂的质量。本文将采用薄层色谱鉴别法（TLC）和气相色谱法（GC）对方中豆蔻、肉桂、荜茇进行定性鉴别和定量研究，建立石榴健胃制剂的定性定量方法，以期完善和提升石榴健胃制剂标准，全面控制制剂质量。
1.1 仪器
薄层点样和成像系统（瑞士CAMAG公司）；
7890B型气相色谱仪（Agilent科技有限公司）；
AR5120型百分之一电子天平（上海OHAUS公司）；
SQP型万分之一电子天平、MSA225-ICEDI型十万分之一电子天平（德国Sartrious公司）；
DT1028CH型超声波提取器（德国BANDELIN公司）；
Milli-Q advantage A10超纯水系统（Merck millipore）；
硅胶板（青岛海洋化工厂/默克公司）。
1.2 试药
对照药材肉桂（批号：121363-201703）、荜茇（批号：121023-201103）；
对照品桉油精（批号：110788-201105，纯度：99.9%）、桂皮醛（批号：110710-202022，纯度：99.5%）、胡椒碱（批号：110775-201706，纯度：98.9%）（中国食品药品检定研究院）。石榴健胃制剂中石榴子（安石榴科植物石榴Punica granntumL.）、红花（菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.）、肉桂（樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl）、荜茇（胡椒科植物荜茇Piper longumL.）、豆蔻（姜科植物白豆蔻Amomum kravanhPierreex Gagnep.）等药材饮片（四川荷花池药材市场，经青海省药品检验检测院藏药检测中心杨凤梅主任药师鉴定）。石榴健胃制剂共26个批次，来自青海、甘肃、西藏自治区的5家生产企业，均为市售药品（见表1）。
表1 石榴健胃制剂样品信息Tab 1 Sample information of Shiliu Jianwei preparation
2.1 薄层色谱对肉桂、荜茇的鉴别
2.1.1 豆蔻鉴别 取石榴健胃丸、片适量，研细，称取5 g；
石榴健胃散称取5 g，加入300 mL的水，挥发油提取器加水至3 mL，加入2 mL正己烷，连接回流冷凝管，加热至微沸继续加热3 h，放冷，取正己烷液，通过铺有无水硫酸钠约1 g的漏斗过滤，收集滤液，挥发油测定器内壁用2 mL正己烷洗涤，洗液合并滤液，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液；
取豆蔻对照药材5 g，同法制成对照药材溶液。取桉油精对照品，加正己烷制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；
按石榴健胃丸的处方和工艺制备缺豆蔻的阴性样品5 g，并按供试品溶液方法制成阴性样品溶液。按2020年版《中国药典》四部TLC法，吸取供试品溶液10 μL，对照药材溶液、对照品溶液各1 μL，阴性样品溶液10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（15∶5∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，日光下立即检视。供试品色谱中，在与豆蔻对照药材、桉油精对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，结果见图1。
图1 豆蔻薄层色谱图Fig 1 TLC chromatogram of Cardamom
2.1.2 肉桂鉴别 取石榴健胃丸、片适量，研细，称取3 g；
石榴健胃散称取3 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，滤液作为供试品溶液；
取肉桂对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。取桂皮醛对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液；
按石榴健胃丸的处方和工艺制备缺肉桂的阴性样品3 g，并按供试品溶液方法制成阴性样品溶液。按2020年版《中国药典》四部TLC法，吸取供试品溶液10 μL，对照药材溶液、对照品溶液各2 μL，阴性样品溶液10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷二硝基苯肼乙醇试液，置日光灯下检视。供试品色谱中，在与肉桂对照药材、桂皮醛对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，结果见图2。
图2 肉桂薄层色谱图Fig 2 TLC chromatogram of Cinnamon
2.1.3 荜茇鉴别 取石榴健胃丸、片适量，研细，称取3 g；
石榴健胃散称取3 g，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤液浓缩至2 mL，作为供试品溶液；
取荜茇对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。取胡椒碱对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液；
按石榴健胃丸的处方和工艺制备缺荜茇的阴性样品3 g，并按供试品溶液方法制成阴性样品溶液。按2020年版《中国药典》四部TLC法，吸取上述4种溶液10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（3∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，置紫外灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与荜茇对照药材、胡椒碱对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性样品无干扰，结果见图3。
图3 荜茇薄层色谱图Fig 3 TLC chromatogram of Cubeb longum
2.2 制剂中桉油精、桂皮醛、胡椒碱的含量测定
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent DB-5毛细管柱（30 m×0.250 mm×0.25 μm）；
进样口温度：230℃；
分流比20∶1；
检测器（FID）温度：250℃；
流量控制模式：恒流模式；
载气（氮气）：40 mL·min-1；
氢气：40 mL·min-1；
空气：400 mL·min-1；
流量：1.0 mL·min-1；
柱温为程序升温，初始温度：50℃，保持10 min；
以5℃·min-1的速率升温至180℃，保持30 min；
再以5℃·min-1的速率升温至240℃，保持30 min。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取桉油精59.13 mg、桂皮醛458.19 mg、胡椒碱31.34 mg分别置于25、50、10 mL棕色量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，即得约含桉油精2.36 mg·mL-1、桂皮醛9.12 mg·mL-1和胡椒碱3.10 mg·mL-1的对照品储备液。分别精密吸取上述各对照品储备液0.5、0.3、2.0 mL置于10 mL量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，即得混合对照品溶液（含桉油精0.12 mg·mL-1，桂皮醛0.27 mg·mL-1，胡椒碱0.62 mg·mL-1）。
2.2.3 供试品溶液的制备 取石榴健胃丸适量，研细，称取5.0 g；
石榴健胃片20片，研细，称取5.0 g；
石榴健胃散称取5.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇20 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.4 阴性样品溶液的制备 按石榴健胃制剂处方比，分别取缺豆蔻、缺肉桂、缺荜茇阴性样品，依照“2.2.3”项下方法，分别制备得缺豆蔻、缺肉桂、缺荜茇的阴性样品溶液，备用。
2.2.5 专属性试验 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品、供试品及阴性样品溶液进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱中，在桉油精、桂皮醛、胡椒碱混合对照品色谱峰相应位置上有相同保留时间色谱峰，且阴性样品无干扰，见图4。
图4 石榴健胃制剂的气相色谱图Fig 4 Gas chromatogram of Shiliu Jianwei preparation
2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取不同量的桉油精（2.36 mg·mL-1）、桂皮醛（9.12 mg·mL-1）、胡椒碱（3.10 mg·mL-1）对照品储备液置10 mL棕色量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得各系列浓度的混合对照品溶液，进样分析，记录对应的峰面积。待测成分质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），得到3种成分的线性关系，结果见表2。
2.2.7 检测限与定量限 取混合对照溶液，按逐步稀释法，按信噪比3∶1、10∶1分别测得各成分的检测限和定量限，见表2。
表2 桉油精、桂皮醛和胡椒碱线性关系考察结果Tab 2 Linearity of eucalyptol，cinnamaldehyde and piperine
2.2.8 稳定性试验 取供试品溶液（S17），分别在0、2、4、10、18及24 h进样测定，结果表明供试品中桉油精、胡椒碱在24 h内均稳定性良好，其峰面积RSD值分别为0.67%、0.95%；
桂皮醛在10 h内稳定性良好，峰面积RSD为0.62%。
2.2.9 精密度试验 精密吸取含桉油精（0.12 mg·mL-1）、桂皮醛（0.27 mg·mL-1）、胡椒碱（0.62 mg·mL-1）的混合对照品溶液，连续进样5次，计算桉油精、桂皮醛、胡椒碱峰面积的RSD值分别为1.4%、0.84%及0.61%。结果表明仪器精密度良好。
2.2.10 重复性试验 取供试品（S17），精密称取6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定桉油精、桂皮醛、胡椒碱的含量的平均值分别为0.24、0.39、1.51 mg·g-1，RSD值分别为1.4%、0.89%、0.20%，表明方法重现性良好。
2.2.11 回收试验 取已知含量样品（S17）6份，精密加入无水乙醇配制的桉油精（120.126 μg·mL-1）、桂皮醛（195.09 μg·mL-1）、胡椒碱（740.07 μg·mL-1）的混合对照品溶液5 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算平均回收率分别为99.42%、100.03%、99.79%，RSD值分别为1.4%、0.82%、0.30%。
2.2.12 样品含量测定 将26批样品按照“2.2.2”方法制成供试品溶液，进样测定，分别计算桉油精、桂皮醛、胡椒碱的含量，结果见表3。
2.3 限度确定
依据表3测定结果并参照《中国药典》2020年版一部对豆蔻、肉桂、荜茇中桉油精、桂皮醛、胡椒碱含量限度要求[规定桉油精（豆蔻）不得低于3.0%；
桂皮醛（肉桂）不得低于1.5%；
胡椒碱（荜茇）不得低于2.5%]，同时考虑到3种成分均为挥发性成分，生产工艺中对温度较为敏感。将桉油精的转化率10%、桂皮醛的转化率20%、胡椒碱的转化率75%计算，则石榴健胃制剂中桉油精含量不得少于0.11 mg·g-1，桂皮醛含量不得少于0.20 mg·g-1，胡椒碱含量不得少于0.85 mg·g-1。
表3 石榴健胃制剂中桉油精、桂皮醛、胡椒碱含量测定结果(mg·g-1)Tab 3 Determination of eucalyptol，cinnamaldehyde and piperine in Shiliu Jianwei preparation (mg·g-1)
3.1 定性鉴别方法的选择
曾对各现行标准薄层鉴别方法结果进行了对比，发现各现行标准存在着斑点Rf值过高、不清晰、专属性不强等问题。为此课题组对展开剂、提取方法等进行了考察，对肉桂、荜茇分别选用了无水乙醇、乙醇及甲醇作为提取溶剂，选用超声30 min、20 min，振摇20 min、30 min的提取方法进行综合交叉考察；
豆蔻展开剂采用石油醚-乙酸乙酯（4∶1）、甲苯-乙酸乙酯（9∶1）等，肉桂展开剂采用石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）及乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇（7∶2∶3∶0.4）进行了考察；
结果发现采用本文方法可得到斑点清晰、分离度较好、专属性较强的结果。
3.2 供试品溶液提取条件选择
考察了超声、加热回流等不同提取方法进行提取，结果超声提取效果最好。同时对提取溶剂（正己烷、无水乙醇）、超声时间（20、30、40 min）、取样量（2、3、5 g）进行考察，结果显示，取5 g样品加无水乙醇超声30 min效果最好。
3.3 样品质量评价
根据化学成分限度、检测结果及前期对企业问卷调查和实地调研，对比各企业生产参数，发现E企业产品干燥温度为80℃，而其他企业产品干燥温度均≤60℃，这表明部分生产企业在质量控制方面存在一定差异。造成这种差异的原因是原药材质量参差不齐或生产工艺不稳定。为了加强石榴健胃制剂的质量标准，需加强对其中豆蔻、肉桂、荜茇等药材的质量控制；
还需考察生产工艺的稳定性，设置合理生产工艺参数。
3.4 小结
综上，本研究在现行标准基础上，对豆蔻、肉桂、荜茇的TLC鉴定方法进行了提升，建立了可同时测定石榴健胃制剂中桉油精、桂皮醛、胡椒碱含量的新方法，以便提高对豆蔻、肉桂、荜茇等挥发性药味在制剂中的质量均一性。本方法具有较好的精密度和准确度，可以为藏成药石榴健胃制剂的质量评价及标准制订提供依据。
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