藏药石榴健胃丸(片、散)质量标准提升研究

时间:2023-06-14 11:30:02 公文范文 来源:网友投稿

拜礼文,焦兴苹,谭金华,肖华,海平*,张炜*(1. 青海大学医学院,西宁 810016;
. 青海省药品检验检测院/青海省中藏药现代化研究重点试验室/国家药品监督管理局中药(藏药)质量控制重点试验室,西宁 810016)

石榴健胃制剂(包括石榴健胃丸、石榴健胃散、石榴健胃片,以下同)由石榴子、肉桂、豆蔻、荜茇及红花组成,处方源自《四部医典》[1],对于治疗肠易激综合征[2]、功能性消化不良[3]、炎症性肠病[4]及小儿再发性腹痛[5]等疾病有较好的疗效。处方中豆蔻、肉桂、荜茇均含有挥发性成分[6-14],其中桉油精具有抗炎、抗氧化、镇痛、神经保护等作用[15];
桂皮醛具有抗炎、抗肿瘤、抗菌等作用[16];
胡椒碱具有镇痛、抗炎、解痉等作用[17]。

目前,全国生产石榴健胃丸(片、散)的藏药生产厂家有8家,对于石榴健胃制剂的定性和定量分析,各现行标准参差不齐,难以全面评价该制剂的质量。本文将采用薄层色谱鉴别法(TLC)和气相色谱法(GC)对方中豆蔻、肉桂、荜茇进行定性鉴别和定量研究,建立石榴健胃制剂的定性定量方法,以期完善和提升石榴健胃制剂标准,全面控制制剂质量。

1.1 仪器

薄层点样和成像系统(瑞士CAMAG公司);
7890B型气相色谱仪(Agilent科技有限公司);
AR5120型百分之一电子天平(上海OHAUS公司);
SQP型万分之一电子天平、MSA225-ICEDI型十万分之一电子天平(德国Sartrious公司);
DT1028CH型超声波提取器(德国BANDELIN公司);
Milli-Q advantage A10超纯水系统(Merck millipore);
硅胶板(青岛海洋化工厂/默克公司)。

1.2 试药

对照药材肉桂(批号:121363-201703)、荜茇(批号:121023-201103);
对照品桉油精(批号:110788-201105,纯度:99.9%)、桂皮醛(批号:110710-202022,纯度:99.5%)、胡椒碱(批号:110775-201706,纯度:98.9%)(中国食品药品检定研究院)。石榴健胃制剂中石榴子(安石榴科植物石榴Punica granntumL.)、红花(菊科植物红花Carthamus tinctoriusL.)、肉桂(樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl)、荜茇(胡椒科植物荜茇Piper longumL.)、豆蔻(姜科植物白豆蔻Amomum kravanhPierreex Gagnep.)等药材饮片(四川荷花池药材市场,经青海省药品检验检测院藏药检测中心杨凤梅主任药师鉴定)。石榴健胃制剂共26个批次,来自青海、甘肃、西藏自治区的5家生产企业,均为市售药品(见表1)。

表1 石榴健胃制剂样品信息Tab 1 Sample information of Shiliu Jianwei preparation

2.1 薄层色谱对肉桂、荜茇的鉴别

2.1.1 豆蔻鉴别 取石榴健胃丸、片适量,研细,称取5 g;
石榴健胃散称取5 g,加入300 mL的水,挥发油提取器加水至3 mL,加入2 mL正己烷,连接回流冷凝管,加热至微沸继续加热3 h,放冷,取正己烷液,通过铺有无水硫酸钠约1 g的漏斗过滤,收集滤液,挥发油测定器内壁用2 mL正己烷洗涤,洗液合并滤液,摇匀,滤过,滤液作为供试品溶液;
取豆蔻对照药材5 g,同法制成对照药材溶液。取桉油精对照品,加正己烷制成每1 mL含1 mg的溶液,作为对照品溶液;
按石榴健胃丸的处方和工艺制备缺豆蔻的阴性样品5 g,并按供试品溶液方法制成阴性样品溶液。按2020年版《中国药典》四部TLC法,吸取供试品溶液10 μL,对照药材溶液、对照品溶液各1 μL,阴性样品溶液10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯(15∶5∶0.5)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,日光下立即检视。供试品色谱中,在与豆蔻对照药材、桉油精对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性样品无干扰,结果见图1。

图1 豆蔻薄层色谱图Fig 1 TLC chromatogram of Cardamom

2.1.2 肉桂鉴别 取石榴健胃丸、片适量,研细,称取3 g;
石榴健胃散称取3 g,加甲醇10 mL,超声处理30 min,滤过,滤液作为供试品溶液;
取肉桂对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。取桂皮醛对照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液;
按石榴健胃丸的处方和工艺制备缺肉桂的阴性样品3 g,并按供试品溶液方法制成阴性样品溶液。按2020年版《中国药典》四部TLC法,吸取供试品溶液10 μL,对照药材溶液、对照品溶液各2 μL,阴性样品溶液10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(17∶3)为展开剂,展开,取出,晾干,喷二硝基苯肼乙醇试液,置日光灯下检视。供试品色谱中,在与肉桂对照药材、桂皮醛对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性样品无干扰,结果见图2。

图2 肉桂薄层色谱图Fig 2 TLC chromatogram of Cinnamon

2.1.3 荜茇鉴别 取石榴健胃丸、片适量,研细,称取3 g;
石榴健胃散称取3 g,加甲醇20 mL,超声处理30 min,滤液浓缩至2 mL,作为供试品溶液;
取荜茇对照药材1 g,同法制成对照药材溶液。取胡椒碱对照品,加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液,作为对照品溶液;
按石榴健胃丸的处方和工艺制备缺荜茇的阴性样品3 g,并按供试品溶液方法制成阴性样品溶液。按2020年版《中国药典》四部TLC法,吸取上述4种溶液10 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯(3∶2)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,置紫外灯(365 nm)下检视。供试品色谱中,在与荜茇对照药材、胡椒碱对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性样品无干扰,结果见图3。

图3 荜茇薄层色谱图Fig 3 TLC chromatogram of Cubeb longum

2.2 制剂中桉油精、桂皮醛、胡椒碱的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent DB-5毛细管柱(30 m×0.250 mm×0.25 μm);
进样口温度:230℃;
分流比20∶1;
检测器(FID)温度:250℃;
流量控制模式:恒流模式;
载气(氮气):40 mL·min-1;
氢气:40 mL·min-1;
空气:400 mL·min-1;
流量:1.0 mL·min-1;
柱温为程序升温,初始温度:50℃,保持10 min;
以5℃·min-1的速率升温至180℃,保持30 min;
再以5℃·min-1的速率升温至240℃,保持30 min。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取桉油精59.13 mg、桂皮醛458.19 mg、胡椒碱31.34 mg分别置于25、50、10 mL棕色量瓶中,用无水乙醇溶解并定容至刻度,即得约含桉油精2.36 mg·mL-1、桂皮醛9.12 mg·mL-1和胡椒碱3.10 mg·mL-1的对照品储备液。分别精密吸取上述各对照品储备液0.5、0.3、2.0 mL置于10 mL量瓶中,用无水乙醇稀释至刻度,即得混合对照品溶液(含桉油精0.12 mg·mL-1,桂皮醛0.27 mg·mL-1,胡椒碱0.62 mg·mL-1)。

2.2.3 供试品溶液的制备 取石榴健胃丸适量,研细,称取5.0 g;
石榴健胃片20片,研细,称取5.0 g;
石榴健胃散称取5.0 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入无水乙醇20 mL,称定重量,超声处理30 min,放冷,再称定重量,用无水乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 按石榴健胃制剂处方比,分别取缺豆蔻、缺肉桂、缺荜茇阴性样品,依照“2.2.3”项下方法,分别制备得缺豆蔻、缺肉桂、缺荜茇的阴性样品溶液,备用。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品、供试品及阴性样品溶液进样测定,记录色谱图。供试品溶液色谱中,在桉油精、桂皮醛、胡椒碱混合对照品色谱峰相应位置上有相同保留时间色谱峰,且阴性样品无干扰,见图4。

图4 石榴健胃制剂的气相色谱图Fig 4 Gas chromatogram of Shiliu Jianwei preparation

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取不同量的桉油精(2.36 mg·mL-1)、桂皮醛(9.12 mg·mL-1)、胡椒碱(3.10 mg·mL-1)对照品储备液置10 mL棕色量瓶中,加无水乙醇定容至刻度,摇匀,即得各系列浓度的混合对照品溶液,进样分析,记录对应的峰面积。待测成分质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y),得到3种成分的线性关系,结果见表2。

2.2.7 检测限与定量限 取混合对照溶液,按逐步稀释法,按信噪比3∶1、10∶1分别测得各成分的检测限和定量限,见表2。

表2 桉油精、桂皮醛和胡椒碱线性关系考察结果Tab 2 Linearity of eucalyptol,cinnamaldehyde and piperine

2.2.8 稳定性试验 取供试品溶液(S17),分别在0、2、4、10、18及24 h进样测定,结果表明供试品中桉油精、胡椒碱在24 h内均稳定性良好,其峰面积RSD值分别为0.67%、0.95%;
桂皮醛在10 h内稳定性良好,峰面积RSD为0.62%。

2.2.9 精密度试验 精密吸取含桉油精(0.12 mg·mL-1)、桂皮醛(0.27 mg·mL-1)、胡椒碱(0.62 mg·mL-1)的混合对照品溶液,连续进样5次,计算桉油精、桂皮醛、胡椒碱峰面积的RSD值分别为1.4%、0.84%及0.61%。结果表明仪器精密度良好。

2.2.10 重复性试验 取供试品(S17),精密称取6份,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,测定桉油精、桂皮醛、胡椒碱的含量的平均值分别为0.24、0.39、1.51 mg·g-1,RSD值分别为1.4%、0.89%、0.20%,表明方法重现性良好。

2.2.11 回收试验 取已知含量样品(S17)6份,精密加入无水乙醇配制的桉油精(120.126 μg·mL-1)、桂皮醛(195.09 μg·mL-1)、胡椒碱(740.07 μg·mL-1)的混合对照品溶液5 mL,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,进样测定,计算平均回收率分别为99.42%、100.03%、99.79%,RSD值分别为1.4%、0.82%、0.30%。

2.2.12 样品含量测定 将26批样品按照“2.2.2”方法制成供试品溶液,进样测定,分别计算桉油精、桂皮醛、胡椒碱的含量,结果见表3。

2.3 限度确定

依据表3测定结果并参照《中国药典》2020年版一部对豆蔻、肉桂、荜茇中桉油精、桂皮醛、胡椒碱含量限度要求[规定桉油精(豆蔻)不得低于3.0%;
桂皮醛(肉桂)不得低于1.5%;
胡椒碱(荜茇)不得低于2.5%],同时考虑到3种成分均为挥发性成分,生产工艺中对温度较为敏感。将桉油精的转化率10%、桂皮醛的转化率20%、胡椒碱的转化率75%计算,则石榴健胃制剂中桉油精含量不得少于0.11 mg·g-1,桂皮醛含量不得少于0.20 mg·g-1,胡椒碱含量不得少于0.85 mg·g-1。

表3 石榴健胃制剂中桉油精、桂皮醛、胡椒碱含量测定结果(mg·g-1)Tab 3 Determination of eucalyptol,cinnamaldehyde and piperine in Shiliu Jianwei preparation (mg·g-1)

3.1 定性鉴别方法的选择

曾对各现行标准薄层鉴别方法结果进行了对比,发现各现行标准存在着斑点Rf值过高、不清晰、专属性不强等问题。为此课题组对展开剂、提取方法等进行了考察,对肉桂、荜茇分别选用了无水乙醇、乙醇及甲醇作为提取溶剂,选用超声30 min、20 min,振摇20 min、30 min的提取方法进行综合交叉考察;
豆蔻展开剂采用石油醚-乙酸乙酯(4∶1)、甲苯-乙酸乙酯(9∶1)等,肉桂展开剂采用石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯(17∶3)及乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)进行了考察;
结果发现采用本文方法可得到斑点清晰、分离度较好、专属性较强的结果。

3.2 供试品溶液提取条件选择

考察了超声、加热回流等不同提取方法进行提取,结果超声提取效果最好。同时对提取溶剂(正己烷、无水乙醇)、超声时间(20、30、40 min)、取样量(2、3、5 g)进行考察,结果显示,取5 g样品加无水乙醇超声30 min效果最好。

3.3 样品质量评价

根据化学成分限度、检测结果及前期对企业问卷调查和实地调研,对比各企业生产参数,发现E企业产品干燥温度为80℃,而其他企业产品干燥温度均≤60℃,这表明部分生产企业在质量控制方面存在一定差异。造成这种差异的原因是原药材质量参差不齐或生产工艺不稳定。为了加强石榴健胃制剂的质量标准,需加强对其中豆蔻、肉桂、荜茇等药材的质量控制;
还需考察生产工艺的稳定性,设置合理生产工艺参数。

3.4 小结

综上,本研究在现行标准基础上,对豆蔻、肉桂、荜茇的TLC鉴定方法进行了提升,建立了可同时测定石榴健胃制剂中桉油精、桂皮醛、胡椒碱含量的新方法,以便提高对豆蔻、肉桂、荜茇等挥发性药味在制剂中的质量均一性。本方法具有较好的精密度和准确度,可以为藏成药石榴健胃制剂的质量评价及标准制订提供依据。

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