黄琦逸，齐宇欣，毛宏晖，武胜昔，王文挺，姜 鸣(延安大学生命科学学院生物学系，陕西 延安 76000；
空军军医大学基础医学院神经生物学教研室，陕西 西安 7003)
在神经科学领域中，研究脑萎缩、帕金森综合征、阿尔茨海默症、孤独症、脊髓损伤修复等疾病的神经环路机制时，小鼠是常用的实验对象[1-2]。小鼠作为多种实验动物模型，其优点在于遗传高度保守、个体间重复性和一致性较好、体形小、饲养维护成本低、生殖周期短，在科学研究中发挥了非常重要的作用[3-5]。目前，利用小鼠基因和人类基因高度相似的特点，研究者采用如敲除、敲入和转基因等手段制作了不同种类的基因修饰小鼠。通过对这些小鼠的基因组测序、转录组测序及代谢组学测序等可深度探索疾病的病因和遗传发育机制，极大地促进了科学研究[6-7]。而实验动物管理委员会要求在动物实验中需要遵从3R原则：替代(replacement)、减少(reduction)和优化(refinement)，旨在减少实验动物用量，减轻动物痛苦[8-9]。因此，在使用实验小鼠时应尽可能地缩减实验周期，优化小鼠繁育，短时间内获取足够数量的小鼠，从而减少不必要的饲养和安乐死。在评估小鼠生殖繁育状况时，目前最常用的是观察小鼠终生生育力并从生产性交配的总体比例、配种-生产间期、产仔数、小鼠整个生殖周期内的产仔数等来衡量其繁殖能力[1,4-5]。据文献报道，小鼠的繁育状况受多种因素的综合影响，如MICHAELIS等[10]报道通过增加雄性配种小鼠的睾丸内间质细胞可提高生育率；
KEMP等[11]报道基因型对雌性动物的产仔数量会产生重要作用；
WALTERS等[12]报道雄激素受体敲除会影响小鼠的繁殖情况。然而关于基因修饰小鼠配种影响因素的探讨却很少。因此，本研究追溯了本实验室2 642笼基因修饰小鼠的配种信息及生育状况，通过回顾性研究探讨季节、配种雌雄小鼠的基因型及年龄对新生小鼠数量和配种-生产间期的影响。
1.1 材料
追溯繁育于空军军医大学实验动物中心的2 642笼多种基因型(包括shank3bKO、SSTcre、PVcre、VIPcre、MeCP2Tg1等)、不同年龄段(42～365 d)、体质量为(24±6)g健康配种小鼠的原始配种信息并记录。在整个配种期间，小鼠饲养于空军军医大学实验动物中心SPF级或IVC级动物房内，体质量均控制在正常范围内，恒温(24±1)℃，12 h光/12 h暗循环，每笼3只，自由获取食物和水。所有实验均遵循实验动物保护原则及伦理规范，并符合空军军医大学实验动物福利与伦理委员会要求(许可证号：IACUC-20120721)。
本实验中所追溯的2 642笼小鼠均饲养于啮齿类动物独立通气饲养笼盒系统(LN63FESU，TECNIPLAST S.P.A，意大利)，该系统包含笼盒系统、笼架系统和主机系统。饲养笼盒皆放置于笼架上。主机系统控制动物房内的通风循环且笼架上的进排风口的气流设定在同一水准，偏差小于0.5%，可为动物提供高标准的低NH3、CO2微环境，提供非常适宜的湿度，有效防止含有有害物质或被污染的气体在动物饲养笼间的传播、扩散。该饲养系统可有效防止交叉感染，保护实验动物并可解放人工、节省资源，保障实验人员的健康与安全。
1.2 方法
1.2.1 配种流程 小鼠饲养至成年后，按照一雄配两雌的方法进行配种，观察并记录配种笼小鼠自配种后新生小鼠出生所需的时间(配种-生产间期)及数量，对数据进行多元线性回归分析及单因素分析，得出可能影响新生小鼠数量及配种-生产间期的相关因素。
1.2.2 基因型因素 为探讨配种雌雄小鼠的基因型是否会对新生小鼠的数量及配种-生产间期产生影响，故将本实验所追溯的2 642笼各基因型小鼠分为以下6组：单致病基因修饰、双基因含致病基因修饰、单功能基因修饰、双功能基因修饰、多基因修饰及野生型。
1.2.3 年龄因素 本实验所追溯的2 642笼配种雌、雄小鼠的年龄涵盖42～365 d，跨度较大，为探讨年龄因素是否会影响新生小鼠的数量及配种-生产间期，故将本实验中所筛选的配种雌、雄小鼠按配种时的年龄分为青年期(42～120 d)、中年期(121～300 d)、老年期(>300 d)。
1.2.4 季节因素 由于小鼠配种及繁殖的周期较长，时间跨度大，季节变化可能会通过影响动物周期性节律，从而影响新生小鼠数量及配种-生产间期，因此为探讨季节因素是否会对其产生影响，故将所追溯的配种小鼠分为4组：春季、夏季、秋季和冬季。
表1 自变量赋值情况
2.1 多因素对配种基因修饰小鼠生育状况的影响
由于季节因素、配种雌雄小鼠的基因型及年龄并非独立地影响新生小鼠的数量和配种-生产间期，可能是由多种因素综合作用的结果，因此我们通过多元线性回归分析探究何种因素会对配种小鼠的生育状况产生影响。
多元线性回归结果显示，在学生化剔除残差-标准化预测值散点图中纵轴零点对应的直线上下基本分布均匀(图1A)，说明残差具备方差齐性；
在残差分布直方图中残差分布与正态分布曲线拟合较好(图1B)，观测累计概率P-P图中散点密切地分布在斜线附近(图1C)，说明残差服从正态分布。残差同时满足方差齐性和正态性，说明所建立的回归模型较好。通过强行进入法筛选模型的自变量结果显示配种雌性小鼠年龄回归系数(P<0.001)、配种雄性小鼠年龄回归系数(P=0.007)、配种雌性小鼠基因型回归系数(P=0.018)及配种雄性小鼠基因型回归系数(P=0.002)均拒绝原假设，说明以上这些自变量和因变量之间的线性关系是显著的；
季节回归系数(P=0.803)未出现显著性，因此未纳入回归模型中(表2)。上述结果表明，配种雌雄小鼠的基因型和年龄对新生小鼠的数量有显著性影响，而季节对新生小鼠的数量无显著性影响。
表2 新生小鼠数量回归模型系数表
A：学生化剔除残差-标准化预测值散点图，自变量为新生数量；
B：残差分布直方图，自变量为新生数量；
C：观测量累计概率P-P图，自变量为新生数量；
D：学生化剔除残差-标准化预测值散点图，自变量为配种-生产间期；
E：残差分布直方图，自变量为配种-生产间期；
F：观测量累计概率P-P图，自变量为配种-生产间期。图1 多元线性回归的模型评估
另一方面，新生小鼠的配种-生产间期的多元线性回归结果[学生化剔除残差-标准化预测值散点图(图1D)、残差分布直方图(图1E)及观测累计概率P-P图(图1F)]也显示出良好的正态分布性和方差齐性，说明所建立的回归模型较好；
通过强行进入法筛选模型自变量，结果显示季节回归系数(P=0.006)、配种雌性小鼠年龄回归系数(P<0.001)和配种雄性小鼠年龄回归系数(P<0.001)均拒绝原假设，说明以上这些自变量和因变量之间线性关系是显著的；
配种雌性小鼠基因型回归系数(P=1.000)和配种雄性小鼠基因型回归系数(P=0.293)均未出现显著性，因此未纳入回归模型中(表3)。上述结果表明，季节和配种雌雄小鼠年龄对新生小鼠的配种-生产间期有显著性影响，而配种雌雄小鼠的基因型对新生小鼠的配种-生产间期无显著性影响。
表3 新生小鼠配种-生产间期回归模型系数表
2.2 各因素不同水平对配种基因修饰小鼠生育状况的影响
多元线性回归分析筛选出对小鼠生育状况有显著性影响的危险因素后，通过对各自变量进行单因素方差分析来比较各变量内不同水平间小鼠生育状况的差异。研究结果显示，配种雌鼠的年龄(F=33.660，P<0.001，图2A)、配种雌鼠的基因型(F=10.720，P<0.001，图2B)、配种雄鼠的年龄(F=23.430，P<0.001，图2C)、配种雄鼠的基因型(F=3.519，P=0.004，图2D)均存在显著性差异。事后多重比较结果显示当配种雌鼠年龄为青年期[新生小鼠为(7.677±3.883)只]及基因型为野生型[新生小鼠为(8.290±4.031)只]、且配种雄鼠的年龄为青年期[新生小鼠为(7.912±3.919)只]及基因型为多基因[新生小鼠为(9.333±4.387)只]时，新生小鼠的数量可最大化。
A：比较配种雌性小鼠年龄对产仔数的影响；
B：比较配种雌性小鼠基因型对产仔数的影响；
C：比较配种雄性小鼠年龄对产仔数的影响；
D：比较配种雄性小鼠基因型对产仔数的影响。SPGM：单致病基因修饰；
DGCPGM：双基因含致病基因修饰；
SFGM：单功能基因修饰；
DFGM：双功能基因修饰；
PGM：多基因修饰；
WT：野生型。小提琴图中的上下虚线表示四分位间距，中间线表示中值。
aP<0.05， bP<0.01。图2 各种因素对产仔数的影响
另一方面，本研究对影响新生小鼠配种-生产间期的各因素分别进行单因素方差分析，结果显示季节(F=4.118，P=0.006，图3A)，配种雌鼠的年龄(F=1 258.000，P<0.001，图3B),配种雄鼠的年龄(F=1 161.000，P<0.001，图3C)均存在显著性差异。事后多重比较结果发现在春季[配种-生产间期为(103.843±74.536)d]、配种雌鼠年龄为青年期[配种-生产间期为(40.552±20.406)d]且配种雄鼠的年龄为青年期[配种-生产间期为(39.674±21.349)d]时，新生小鼠的配种-生产间期可最短。上述结果表明，在春季选择较为年轻的配种雌雄小鼠可优化小鼠的生育状况。
A：季节因素对于配种-生产间期的影响；
B：配种雌性小鼠年龄对于配种-生产间期的影响；
C：配种雄性小鼠年龄对于配种-生产间期的影响。小提琴图中的上下虚线表示四分位间距，中间线表示中值。
bP<0.01。图3 各种因素对配种-生产间期的影响
在医学、生命科学等诸多领域尤其是神经科学研究中，小鼠模型至关重要[13-14]。由于其生殖周期短、遗传高度保守等优点而被广泛用于各领域的科学研究中，实验小鼠尤其是基因修饰小鼠的使用数量也与日俱增，因此小鼠生育状况与科研工作的推进密切相关[15-17]。目前小鼠生育状况相关的研究多集中于改良新生小鼠的生殖表型[18]、某种理化因子如细胞因子或蛋白分子对小鼠繁殖情况的影响[19-20]和小鼠体外受精人工繁育[21]等，但关于季节、配种小鼠年龄和基因型对新生小鼠数量及配种-生产间期是否产生影响的探讨却很少。
本研究通过追溯10年内2 642笼健康基因修饰雌雄小鼠的配种及生育数据，探究季节、配种雌雄小鼠的年龄及基因型对新生小鼠数量及配种-生产间期的影响。与人相比，动物对于季节变化的感知更为敏感，尤其在进行配种时受季节因素影响较大；
此外，动物在进行配种时的年龄也是影响配种的关键因素之一。多元线性回归分析结果显示配种雌雄小鼠的年龄和基因型均会显著地影响新生小鼠的数量，季节和配种雌雄小鼠的年龄会显著地影响配种-生产间期。配种时雌雄小鼠的年龄处于青年期时生育率相对较高且配种-生产间期相对更短。另一方面，致病基因与功能基因在小鼠进行配种时显著影响新生小鼠的数量，双致病基因修饰[新生小鼠为(6.906±3.579)只]和单致病基因修饰小鼠[新生小鼠为(7.594±3.648)只]在进行配种后比双功能基因修饰[新生小鼠为(6.216±3.137)只]和单功能基因修饰小鼠[新生小鼠为(6.762±3.428)只]的新生数量更多。在此基础上进行的单因素方差分析结果显示配种雌雄小鼠年龄均为青年期且配种雌鼠为野生型及配种雄鼠为多基因型时，新生小鼠的数量可最大化；
另一方面，选择春季和青年期的配种雌雄小鼠可有效地缩短配种-生产间期。综上所述，在春季选择较为年轻的雌雄小鼠配种可快速地获取最大数量的新生小鼠；
在其他季节里，建议选择青年期小鼠进行配种雌雄小鼠，并按照一雄配两雌的方法适当多增加几笼配种；
若繁育的小鼠为基因修饰小鼠，则尽量将多基因修饰雄性小鼠和野生型或多基因修饰雌性小鼠进行配种，可有效地提高新生基因修饰小鼠的数量。但这些因素影响新生小鼠的数量及配种-生产间期的机制仍不清楚，尚需更进一步的研究。
