陈 宏 张明浩 陈 群 宋倩男 张佩颖 赵建云 隋博文
(1 黑龙江中医药大学附属第一医院儿一科，黑龙江省哈尔滨市 150040；
2 黑龙江省哈尔滨市阿城区人民医院检验科，黑龙江省哈尔滨市 150300；
3 黑龙江中医药大学附属第一医院呼吸科，黑龙江省哈尔滨市 150040)
哮喘是一种呼吸道慢性炎症疾病，发作时主要表现为喘鸣、咳嗽、多痰、呼吸急促等症状，病理学检查可见肺部炎症细胞浸润、上皮损伤、支气管平滑肌过度反应、呼吸道水肿及黏液增加[1]。哮喘反复发作可导致呼吸道结构改变，最终出现纤维化及呼吸道重塑等不可逆的病理表现[2-3]。目前，临床上常用的哮喘药物(如糖皮质激素、支气管扩张剂、茶碱和白三烯调节剂等)可以改善患者机体的炎症状态，但其对呼吸道纤维化及其重塑的影响尚不明确，且长期使用可导致患者的用药依从性下降，疗效欠佳，并有一定的不良反应[4-5]。因此，探讨哮喘的辅助疗法对于提高患者的疗效有重要意义。中医学认为，哮喘以咳、喘、痰为主症，属中医“咳嗽”“哮喘”“痰饮”范畴，病位在肺、脾、肾三脏，尤其是肺。中医典籍中对哮喘的描述始见于《素问·阴阳别论》，其描述“阴争于内，阳扰于外，魄汗未藏，四逆而起，起则熏肺，使人喘鸣”。麻黄为麻黄科植物草麻黄、中麻黄或木贼麻黄的干燥草质茎，又名龙沙、狗骨、卑相、卑盐，始载于《神农本草经》，被列为上品[6]。中医认为麻黄性辛温，味微苦，归肺、膀胱经，有发汗解表、宣肺平喘、利水消肿之功效。研究发现，麻黄提取物具有缓解支气管平滑肌痉挛的作用[7]。细辛的主要有效成分包括甲基丁香酚、γ-细辛醚、细辛素、芝麻素等，具有抗炎作用，对哮喘具有一定疗效，常被用于哮喘患儿的辅助治疗[8]。但麻黄和细辛对哮喘患者肺组织学的影响如何，目前尚不清楚。为此，本研究建立哮喘小鼠模型，观察麻黄-细辛药对提取物对哮喘小鼠肺组织病理变化、气道炎性反应等指标的影响，以期为麻黄-细辛药治疗哮喘提供参考依据。
1.1 实验动物 无特定病原体级Balb/c小鼠30只，雌雄各半，周龄4～6(4.97±0.46)周，体质量18～22(20.05±0.86)g。小鼠由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供[许可证号：scxk(鲁)20140007]。将小鼠置于12 h光暗周期中适应性喂养1周，所有小鼠均分笼喂养，自由饮食及饮水。本研究符合《实验动物管理条例》相关规定。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器：紫外可见分光光度计(OLYMPUS公司，型号：CKX31)，荧光显微镜(ZEISS公司，型号：Axio Scope A1)，低温高速离心机(Eppendorf公司，型号：5810R)，旋转式蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-52型)，酶标仪(BIO-RAD公司，型号：450 型)。
1.2.2 试剂：麻黄饮片(产地甘肃，批号：20200315)、细辛饮片(产地黑龙江，批号：20200418)均购自哈药集团世-堂制药厂；
小鼠白细胞介素(interleukin，IL)-6 ELISA检测试剂盒(批号：149320012)、小鼠IL-17 ELISA检测试剂盒(批号：128450025)、兔抗人Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)多克隆抗体(批号：728109)、总RNA提取试剂盒(批号：2019-10-AP)均购自北京盒子生工科技有限公司；
转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)抗体(批号：2018-2-AP)购自Santa Cruz公司；
α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(批号：12873-1-AP)购自Abcam 公司；
95%乙醇、苯酚、浓硫酸(批号：202006、202007、202006)购自上海化学试剂有限公司试剂厂；
兔抗小鼠β-actin抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体均购自上海榕柏生物技术有限公司(批号：20201116、20190426)。
1.3 麻黄-细辛药对提取物的制备 取麻黄饮片3.0 kg和细辛饮片1.5 kg，先加入600 mL无水乙醇充分浸润，再加入4.8 L无水乙醇加热煮沸后回流提取2 h。趁热使用3层纱布过滤，取滤渣，再用4.8 L三蒸水加热回流提取2 h。趁热过滤，合并2次滤液，于真空减压浓缩罐进行减压浓缩,干燥箱烘干成浸膏，最后冷冻干燥制成干粉，计算得到1 g干粉相当于6.34 g生药。
1.4 分组、哮喘小鼠模型的建立及干预方法 根据随机数字表法将30只Balb/c小鼠分为对照组、模型组、麻黄-细辛组，各10只。适应性饲养1周后开始造模。除对照组外，其他2组均按以下方法建立哮喘小鼠模型[9]：分别于实验的第1天、第7天、第14天对小鼠进行致敏干预，即于第1天、第7天皮下注射卵清蛋白(北京索莱宝科技有限公司，批号：B20210812)10 mg和氢氧化铝凝胶(Sigma-Aldrich Lab & Production Materials公司，批号：20483-21-2)200 mg；
第14天开始，将小鼠置于30 cm×15 cm×10 cm的不完全封闭式透明容器内，将5 mL含2%卵清蛋白的水溶液放入超声雾化器，给予小鼠雾化30 min，连续激发7 d；
第21天开始给予3组小鼠连续吸入雾化激发液4 d，1次/d，30 min/次，雾化激发液为5 mL含3%卵清蛋白的水溶液。建模成功标准为：小鼠打喷嚏、抓耳挠鼻，喘息，毛发无光，活动量减少。建模期间给予对照组等量的0.9%氯化钠雾化吸入。建模后的第18天起，每天给予各组小鼠相应药物雾化干预，麻黄-细辛组药物为0.08 g/kg麻黄和0.16 g/kg细辛药对提取物+4 mL生理盐水，对照组和模型组雾化药物为等体积生理盐水，均于激发试验前1 h进行雾化干预，连续7 d，1次/d。
1.5 标本采集及观察指标的检测方法
1.5.1 气道反应性：于末次治疗结束待小鼠呼吸稳定后，分别给予0 mg/mL、3.125 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL倍增浓度的乙酰甲胆碱雾化吸入，且使用肺功能检测系统测定相应乙酰甲胆碱浓度下的增强呼气间歇值(enhance pause，Penh)。Penh=[(呼气时间/松弛时间)-1]×(最大呼吸流量/最大吸气量)。Penh越高说明气道反应性越高。
1.5.2 采集标本：气道反应性测定完成后，使用5%的水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉各组小鼠，结扎左侧主支气管，经气管插管，以4 ℃预冷的无菌平衡盐溶液行支气管肺泡灌洗6 次，0.5 mL/次，收集支气管肺泡冲洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。随后对小鼠进行开胸手术，分别取左右肺组织，将未灌洗过的右上叶肺组织置于4%中性甲醛固定液，将右下肺组织保存于液氮。通过眼眶后静脉丛采血获取血液样本。
1.5.3 肺组织形态学：取未灌洗过的右上叶肺组织置于4%中性甲醛固定液48 h，然后进行冲洗、酒精梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，将切片烤干后进行脱蜡处理，之后置入不同浓度的酒精中脱水3 min，使用苏木精染色5 min后流水清洗3次，使用盐酸酒精分化处理30 s，充分清洗后使用0.5%伊红液染色1～3 min，使用酒精脱水后进行脱蜡处理，使用中性树胶封固。显微镜下观察并拍照。
1.5.4 BALF的白细胞计数和分类：使用Diff-Quik染色液染色BALF细胞涂片后，光学显微镜下对BALF的白细胞进行分类和计数，包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞的比例。
1.5.5 BALF和血清的IL-6及IL-17水平：取1.5.2获取的BALF，将其过200目细胞筛后离心，轻轻倾倒出BALF上清液备用。取1.5.2的眼眶血标本，于4 ℃下以300 r/min离心15 min，收集血清，严格按照ELISA试剂盒说明书操作检测BALF和血清的IL-6及IL-17水平，于酶标仪450 nm波长处读取各孔的吸光度值，绘制标准曲线，计算样品浓度。
1.5.6 肺组织中YAP的表达水平：采用免疫组化染色法，取保存于液氮中的右下肺组织，加 BSA封闭液室温反应10 min以封闭抗体；
弃去多余液体，滴加兔抗人YAP多克隆抗体，利用Image-pro Plus 6.0软件测定阳性部位吸光度值。
1.5.7 肺组织YAP mRNA的表达水平：取保存于液氮中的右下肺组织，参照TRIzol试剂(上海索宝生物科技有限公司，批号：15732-048)说明书提取肺组织总RNA，使用紫外可见分光光度法检测RNA纯度，参照反转录试剂盒说明书将RNA反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增。引物由上海吉玛制药技术有限公司合成设计。YAP上游引物为5′-CCATAAGAACAAGACCACATAAT-3′，下游引物为5′-CCTCTCCTTCTCCATCTGTAGC-3′；
内参β-actin上游引物为5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物为5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。反应体系为包括cDNA模板1 μL、SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、QN ROX Reference Dye 2 μL、上下游引物各1 μL、RNase-Free水5 μL，总体积20 μL。反应条件为94 ℃预变性5 min；
94 ℃变性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s，共35个循环；
再72 ℃延伸10 min。每份样品设5个复孔。采用2-ΔΔCt法计算肺组织中YAP mRNA 相对表达水平。
1.5.8 肺组织TGF-β1蛋白及α-SMA的表达：称取各组保存于液氮的小鼠右下肺组织，根据说明书配制蛋白裂解液，裂解肺组织后离心提取总蛋白，利用二喹啉甲酸法检测蛋白浓度。取95 ℃高温变性后的150 μg蛋白，进行SDS-PAGE以分离等量蛋白，然后将蛋白转至PVDF膜。使用5%脱脂牛奶于4 ℃封闭PVDF膜1 h，用TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入TGF-β1抗体、α-SMA抗体、兔抗小鼠β-actin抗体(1 ∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入5 μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体(1 ∶1 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5次，5 min/次。以β-actin为内参蛋白，显影曝光后，利用Image-pro Plus图像分析软件对蛋白条带的灰度值进行分析。
1.6 统计学分析 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2.1 3组小鼠肺组织形态学的比较 对照组小鼠肺组织结构正常，支气管管腔内无炎症细胞浸润；
模型组小鼠肺组织支气管腔狭窄，管腔内出现以嗜酸性粒细胞与中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，平滑肌增厚；
与模型组比较，麻黄-细辛组小鼠肺组织支气管腔内有炎症细胞浸润，但浸润程度较轻，支气管管壁轻度增厚。见图1。
图1 3组小鼠的肺组织形态学(HE染色，×400)
2.2 3组小鼠Penh的比较 各组小鼠吸入相应浓度乙酰甲胆碱后，其他两组小鼠Penh均高于对照组，麻黄-细辛组小鼠Penh均低于模型组(均P<0.05)。见表1。
表1 3组小鼠Penh的比较(x±s，%)
2.3 3组小鼠BALF中各类白细胞比例、IL-6及IL-17水平和血清IL-6及IL-17水平的比较 与对照组相比，其他两组小鼠BALF中的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞比例，以及BALF和血清的IL-6及IL-17水平均升高(均P<0.05)。与模型组比较，麻黄-细辛组BALF中的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞比例，以及BALF和血清的IL-6及IL-17水平均降低(均P<0.05)。见表2、表3。
表2 3组小鼠BALF中各类白细胞比例的比较(x±s，%)
表3 3组小鼠BALF和血清IL-6及IL-17水平的比较(x±s，pg/mL)
2.4 3组小鼠肺组织YAP及其mRNA表达水平的比较 与对照组相比，模型组小鼠肺组织YAP及其mRNA表达水平均升高(均P<0.05)；
与模型组相比，麻黄-细辛组小鼠肺组织YAP及其mRNA表达水平均降低(均P<0.05)。见表4。
表4 3组小鼠肺组织中YAP及其mRNA相对表达水平的比较(x±s)
2.5 3组小鼠肺组织TGF-β1蛋白和α-SMA表达水平的比较 与对照组相比，其他两组小鼠肺组织TGF-β1蛋白和α-SMA表达水平均升高(均P<0.05)；
与模型组比较，麻黄-细辛组小鼠肺组织TGF-β1蛋白和α-SMA表达水平均降低(均P<0.05)。见表5，图2。
表5 3组小鼠肺组织TGF-β1蛋白和α-SMA相对表达水平的比较(x±s)
图2 3组小鼠肺组织TGF-β1蛋白和α-SMA电泳条带图
哮喘的主要病理表现为肺部组织炎症细胞浸润、气道上皮损伤、呼吸道水肿及黏液增加[10]。肺部的慢性炎症可引起平滑肌细胞肥大和增生、杯状细胞化生、上皮细胞脱落等变化。这些改变会导致气管壁变厚、气道狭窄、血管增生，引发气道过度反应而导致呼吸困难，其中气道狭窄是一种不可逆的病理变化[11]。目前临床上常用的药物，如糖皮质激素、白三烯受体拮抗药等，能迅速控制气道炎症，效果良好，但是仍然存在一些弊端，如停药后易复发，长期用药导致全身或局部的不良反应等。哮喘，中医称为哮病，是以喉中哮鸣有声、呼吸困难甚至喘息不能平卧为主症的反复发作性肺系疾病，常因气候突变、饮食不当、情志失调、劳累等因素引动伏痰而发，发作前多有鼻痒、喷嚏、咳嗽、胸闷等症状[12]。
麻黄具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿之功，主治风寒感冒、胸闷喘咳、风水浮肿、哮喘。中医认为麻黄的作用以发散与宣肺为主，如蜜麻黄可润肺止咳，多用于表证已解的气喘咳嗽。中药细辛始见于《神农本草经》，为呼吸系统常用中药，常与其他药物配伍用于治疗哮喘[13]。细辛能去风湿、泄肺破痰，主治咳逆上气，并有抗炎、抗过敏、镇咳、平喘、解痉等功效，临床上将其用于治疗头痛、风湿痛、哮喘。细辛的活性成分芝麻素具有抗氧化、抗炎、抗过敏及神经保护的功效，是一种极具开发潜力的药物[14]。《本草纲目》记载，细辛能去风湿、泄肺破痰，主治咳逆上气。《神农本草经》与《名医别录》亦指出，细辛温中下气，能破痰利水、行气宽中、并治喉痹，可治鼻塞、疗咳嗽。本研究通过建立哮喘小鼠模型，观察麻黄-细辛药对提取物对哮喘小鼠症状的改善作用。建模后，模型组小鼠出现打喷嚏、抓耳挠鼻，喘息等症状，且病理组织学结果显示小鼠肺组织支气管管腔狭窄、平滑肌增厚，管腔内出现以嗜酸性粒细胞与中性粒细胞为主的炎症细胞浸润，提示哮喘小鼠模型建模成功。本研究结果显示，模型组小鼠的Penh 及BALF中的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞比例均高于对照组，而麻黄-细辛组上述指标均低于模型组(均P<0.05)，提示麻黄-细辛药对提取物可降低哮喘模型小鼠的气道反应性和炎症反应，改善其症状。
研究显示，IL-17可诱导促纤维化细胞因子和促炎症介质的分泌，如IL-6、IL-11、IL-8等，并可通过诱导自噬导致线粒体功能障碍和支气管纤维化，在哮喘的气道重塑中发挥重要作用[15]。TGF-β1与α-SMA均是与纤维化密切相关的因子。研究显示，抑制TGF-β1、α-SMA的表达对气道重塑具有一定的调控作用[16]。YAP是一种多功能的细胞内连接蛋白和转录共激活因子，可通过抑制Hippo信号通路，减轻气道炎性反应、抑制气道重塑[17]。YAP在哮喘支气管平滑肌中表达上调，其活性与人气道平滑肌细胞增殖密切相关[18]。本研究结果显示，麻黄-细辛组小鼠支气管腔内的炎症细胞浸润及支气管管壁增厚程度均较模型组减轻，提示麻黄-细辛药对提取物有助于改善哮喘模型小鼠的气道重塑。同时，模型组小鼠BALF和血清的IL-6、IL-17水平，以及肺组织中YAP及其mRNA表达水平、TGF-β1蛋白和α-SMA表达水平均高于对照组，而麻黄-细辛组上述指标水平均低于模型组(均P<0.05)。这提示麻黄-细辛药对提取物可能通过下调IL-17、IL-6、TGF-β1、α-SMA、YAP等因子的表达，从而抑制哮喘模型小鼠的气道重塑。
综上所述，麻黄-细辛药对提取物能够减轻哮喘模型小鼠的气道反应性和炎症反应，并可能通过下调IL-17、IL-6、TGF-β1、α-SMA、YAP等因子的表达而抑制哮喘模型小鼠的气道重塑。这或可为中医药治疗哮喘提供新的思路。
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