穆小婷，廖侦成*，凌彩金，郑溪，林建勇，何建平，江丽冰
1.清远市农业科技推广服务中心（清远市农业科学研究所），广东 清远 511500；
2.广东省农业科学院茶叶研究所广东省茶树资源创新利用重点实验室，广东 广州 510640
种质资源的研究和开发是茶叶产业发展的重要基础。目前，茶树种质资源研究主要集中在遗传多样性[1-2]、生化成分多样性[3-5]、形态多样性或表型多样性[6-8]、根系土壤微生物群落多样性[9-11]、抗性研究[12]等方面，遗传多样性分析主要从分子水平上对茶树资源进行研究，包括SSR[13-14]、ISSR[15-17]、RAPD[18]、SRAP[19]、AFLP[20-21]、SRAP[22-23]、SNP[24]等分析方法。其中，SSR分子标记技术作为一种以特定引物的PCR 扩增为基础发展起来的第二代分子标记技术，具有多态性高、重复性好、共显性遗传、操作简单快速、数量丰富等优点，已广泛应用于茶树的遗传多样性分析和亲缘关系分析[25-27]。
清远市位于粤北山区，境内野生茶树资源丰富，种类繁多，品质各异。通过对清远本土野生茶树资源的野外调查和资源采集，对清远8 个县（市、区）的55份代表性野生茶树资源叶片样品进行了SSR 位点多态性分析、群体遗传多样性分析和亲缘关系分析，并对不同来源地的样品进行了遗传一致度和遗传距离分析，综合分析了清远野生茶树资源的遗传多样性和亲缘关系情况，可为进一步开展本土茶树种质资源的研究和开发利用提供参考。
1.1 研究材料
研究所用茶树资源样品来源于广东省清远市的清城区、清新区、英德市、连州市、佛冈县、连山县、连南县、阳山县等8 个县（市、区），样品共55份，对应编号见表1，资源均为当地本土繁殖的代表性野生茶树，包括自然野生茶树和本土茶树种子繁殖的老茶树，茶树叶片有大叶、中叶和小叶等，叶片色泽以绿色和深绿色为主，部分叶片有紫色、紫红色或黄绿色，当地主要制作绿茶、红茶。样品采集方法为随机采摘茶树芽下第三至第五片叶，每份资源采集10 片以上完整、无病虫害、长势正常的叶片样品，采下后擦拭干净，放入样品袋并登记编号，立即用液氮或干冰速冻，并及时运送至－80 ℃冰箱中保存。在野外调查中如不能及时对叶片进行低温保存，则先剪取茶树枝条，将枝条剪口浸泡在盛有清水的瓶中，或用有湿布的袋子包好，或将枝条切口直接插入新鲜萝卜中，保持叶片新鲜，并及时带回有条件保存的地方。带回后立即采集叶片放入样品袋，登记编号，置于－80 ℃冰箱中保存。对保存的样品及时开展提取和分析。
表1 55份茶树种质资源样品来源及对应编号
1.2 研究方法
SSR 分析主要包括样品基因组DNA 提取、SSR 引物筛选及引物PCR 扩增、电泳检测、数据分析等步骤。
1.2.1 基因组DNA的提取
采用由生工生物工程（上海）股份有限公司提供的Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒对55份茶树材料DNA 进行提取，利用柱式植物基因组DNA 抽提试剂盒，通过Buffer PCR 裂解茶树叶片样品，释放出基因组DNA，采用特殊吸附膜选择性吸附核酸分子，去除其他杂质，得到高质量的基因组DNA，提取后及时放入－20 ℃环境中保存备用。
1.2.2 SSR引物的筛选
SSR引物的筛选由生工生物工程（上海）股份有限公司负责，经筛选，选用TM241、TM262、TM341、TM345、TM369、TM442、TM426、TM428、TM440、TM442、TM447、TM461、TM499、TM513、TM569、TM601 共计16 对SSR引物，引物序列信息见表2。
表2 16对多态性引物序列信息
1.2.3 SSR-PCR扩增和电泳检测
主要操作步骤包括：（1）取96 孔反应板，用记号笔标明板名、试验日期。（2）制作电子版SSR检测表，并自动生成上机表。（3）使用连续加样器，吸取990 μL HIDI 和10 μL LIZ500 的混合物，加入到96 孔反应板中，每孔10 μL。（4）将96 孔板置于平板离心机中，用1 200 r/min 离心15 s。（5）使用12 排10 μL 排枪，对照SSR 检测表，在96 孔板对应的孔中加入1 μL样品。（6）将96 孔板置于平板离心机中，1 200 r/min 离心15 s。（7）使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，1 200 r/min 离心30 s，置于PCR 仪。（8）变性。变性程序为温度98 ℃，时间5 min。变性程序结束后立即将96 孔板置于冰水混合物上急速冷却。（9）将96 孔板置于平板离心机中，用1 200 r/min离心15 s。（10）使用3730 ⅩL测序仪进行毛细管电泳检测SSR 样本。PCR 反应体系和扩增条件见表3、表4。
表3 SSR-PCR 扩增反应体系
表4 SSR-PCR扩增条件
1.2.4 数据分析
采用Gnemapper v4.0软件进行序列分析，通过PopGen32 软件计算观测等位基因（Na）、有效等位基因（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）、Shannon多样性指数（I）、遗传分化系数（Fst）、基因流（Nm）等指标，用MEGA 5.1软件进行聚类分析。
2.1 SSR位点多态性分析
通过16 对SSR 引物对8 个县（市、区）共55份样品进行位点多态性分析（表5），16 对SSR 引物共扩增出189 个多态位点，每对引物为3～20个，平均每对引物11.812 5个多态位点。
表5 16对SSR引物的遗传多样性参数
Ne 是反映群体遗传变异大小的指标，其数值越接近Na 的绝对数，表明该等位基因在群体中分布越均匀；
Ne和Na差异越大，说明等位基因在群体中分布越不均匀。16对SSR引物的Ne值范围为1.100 1～11.237 0，均值为5.826 4。
PIC 是评价引物位点多态性的重要指标，当PIC＞0.50 时，表明该位点为高度多态位点；
当0.25＜PIC≤0.50 时，表明该位点为中度多态位点，当PIC≤0.25时，表明该位点为低度多态位点。
16对引物的PIC值范围为0.305 5～0.904 2，均值为0.698 7，其中有13 对引物的PIC 值大于0.50，说明引物绝大多数为高度多态性SSR标记。
2.2 群体遗传多样性分析
Ho 指随机抽取的两个样本等位基因不相同的概率；
He指理论计算得出的杂合度，He的范围从0（说明无多态性）到1（说明无限多个等位基因具有相同的频率，是个极限值）。一般常用He来衡量群体的遗传多样性高低，He 越高，反映群体的遗传一致性越低，其遗传多样性越丰富。Ho 小于He，说明位点纯合子偏多；
Ho大于He，说明位点杂合子偏多；
Ho 等于He，说明位点处于平衡状态。由表5 可知，16 对SSR 引物Ho 为0.056 6～0.836 4，均值为0.539 1；
He 为0.091 8～0.919 5，均值为0.723 8，且16 对引物中，有12 对的He 均在平均值以上，说明55 份资源的遗传多样性丰富；
但是，Ho 平均值明显低于He 平均值，且16对引物的Ho均低于He，说明几乎所有位点都出现了纯合子偏多的现象，这可能是因为在清远境内属小群体分布模式，容易引起近交，从而导致群体内纯合子数量增加。
I也叫香农指数，是比He更能反映遗传多样性程度的指标，I 越大，表明群体离散度越高，遗传多样性越丰富。16对SSR引物I值0.221 8～2.635 6，均值为1.796 8，其中，有8对引物的I大于2.0，进一步说明55份资源的遗传多样性比较丰富。
遗传分化是指遗传多样性在群体内和群体间的分布，Fst代表不同群体间的遗传分化水平，Fst值在0～1 之间。一般来说，Fst 值小于0.05，说明物种群体间的遗传分化水平很低；
Fst 值在0.05～0.15之间，说明群体间的遗传分化水平处于中等程度；
Fst 值在0.15～0.25 之间，说明群体间的遗传分化水平处于中等偏高的程度；
当Fst 值大于0.25，说明群体间的遗传分化水平处于较高程度。55个样品的Fst平均值为0.128 8，说明55份清远野生茶树资源的遗传分化水平中等，同时也说明有87.12%的遗传分化来自群体内，12.88%的遗传分化来自群体间。
Nm是指生物个体从其发生地分散出去而导致不同种群之间基因交流的过程，可发生在同种或不同种的生物种群之间。基因的交流会削弱种群间的遗传差异，是影响种群遗传结构的重要因子。一般来说，当Nm＞1时，表明群体间的Nm水平较高，能足以防止遗传漂变导致种群遗传分化的发生；
Nm＜1，则表明是由遗传漂变导致群体间的遗传分化。55个样品的Nm平均值为1.917 0，说明55份资源群体间的Nm水平较高，遗传分化不是由遗传漂变产生的。
2.3 群体亲缘关系分析
不同种质资源的亲缘关系与其遗传背景有直接关系，遗传背景越近，则相似程度就越高。根据SSR标记计算55份样品的遗传相似系数介于0～0.834 1之间，遗传距离介于0～3.827 7之间，通过MEGA 5.1软件对55个样品进行聚类分析发现，以遗传距离0.53为阈值，55份茶树资源被聚为7个类群，其中，第一类群共30 份种质资源，第二类群共6份资源，第三类群共10份资源，第四类群共1份资源，第五类群共1份资源，第六类群共6份资源，第七类群共1 份资源。以遗传距离0.40 为阈值，第一类群又可以分为4个亚群，第二类群和第三类群也分别分为3个亚群。另外，从样品来源地角度分析，英德市的4个样品聚类在一起，说明英德市的4 个样品亲缘关系近；
连南县12 个样品在遗传距离为0.50 处主要分为两大类群，其中序号25、26、29、30、31 聚类在一起，序号21、22、23、24 聚类在一起，其余几个样品没有形成明显聚类；
其他6 个县（市、区）的样品，整体来看，尚未发现明显聚类（图1）。
图1 55个样本Nei"s遗传距离聚类分析树状图
2.4 各县（市、区）样品遗传多样性分析和亲缘关系分析
2.4.1 各县（市、区）样品遗传多样性分析
遗传多样性对于种群或物种的长期存活及净化潜力至关重要，分析物种遗传多样性的空间分布有助于识别不同的遗传群体。由表6 可以看出，以I 值计，清新区的遗传多样性指数最高，I 值为1.548 2，He值也最高（0.741 5）；
阳山县（1.471 4）排名第二，清城区（1.374 6）排名第三，对应He也排名前列；
英德市的遗传多样性水平最低，I、He值也在8个县（市、区）中最低，分别为0.994 1、0.598 2。
Hardy-Weinberg 遗传偏离指数D（Ho－He）主要反映Ho 和He 之间的平衡关系，D 值越接近0，基因型分布就越接近于平衡状态，D 值大于0，说明存在杂合子过剩；
D 值小于0，说明存在杂合子缺失现象。由表6 可以看出，8 个县（市、区）的群体Ho 均小于He，说明均表现出杂合子缺失、纯合子偏多的现象。其中，英德市的遗传偏离指数D为－0.0513，最接近于平衡状态。阳山县的遗传偏离指数D为－0.2349，最远离平衡状态，纯合子最多，近交程度也最高。
表6 各县（市、区）遗传多样性分析
2.4.2 各县（市、区）样品一致度和遗传距离分析
遗传一致度越高，表明供试茶树品种间遗传距离越近，亲缘关系越近。通过对8 个不同来源地，即8个县（市、区）样品遗传一致度和遗传距离分析，结果（表7）显示，8 个群体的遗传一致度范围为0.554 3～0.842 7，遗传距离范围为0.171 1～0.590 0。阳山县和清城区群体间遗传一致度最大（0.842 7），遗传距离最小（0.171 1），说明阳山县和清城区2个群体的遗传背景较相似，亲缘关系较近；
清新区和连南县的遗传一致度次之（0.836 4）；
而连南县和英德市的遗传一致度最小（0.554 3），遗传距离最大（0.590 0），说明连南县和英德市材料的遗传背景有较大差异，亲缘关系较远。总体来说，8 个县（市、区）样品的遗传一致度都在0.55以上，遗传分化程度较低。
表7 不同来源地材料遗传一致度（对角线以上）和遗传距离（对角线以下）
此外，从群体聚类分析树状图（图2）也可以看出，在遗传距离为0.20处，8个县（市、区）的样品可聚类为两大类，其中群体5（英德市）单独聚类，其余群体聚类在一起，说明英德市群体与其余群体的亲缘关系较远；
而在遗传距离为0.1 处，阳山县和清城区聚类在一起，清新区和连南县聚类在一起，其余4个县（市、区）分别聚类，这和表7中关于遗传相似系数和遗传距离的分析一致，进一步验证了各县（市、区）的亲缘关系情况。
图2 各县（市、区）Nei"s遗传距离聚类分析树状图
茶树资源是茶树品种创新和新品种选育开发的重要基础，对实现茶叶优质高效发挥着重要作用[28]，遗传多样性作为生物所携带遗传信息的总和，对分析重要性状和辅助育种起着不可替代的作用[29-30]，因此，通过遗传多样性分析对茶树种质资源及遗传育种进行研究，越来越受到广大学者的关注。本研究的55 份清远野生茶树种质资源的Ho 平均值为0.539 1、He 平均值为为0.723 8、I 平均值为1.796 8、PIC平均值为0.698 7，一定程度说明清远种质资源的遗传多样性比较丰富[31-32]；
55份资源的Fst 为0.128 8、Nm 为1.917 0，说明群体间存在一定的遗传分化，但遗传分化不是由遗传漂变引起，可能与不同来源地海拔高度或地域差距所处各种生态因子（如气候、温度、土壤等）的差异性有关。
通过聚类分析，55 份茶树资源可聚为7 个类群，其中，来自阳山县的资源19 号、来自佛冈县的资源49号、来自连州市的资源37号分别单独聚类，可作为进一步分析的目标树种。本研究中，来自8 个县（市、区）的55 份茶树种质资源在遗传水平上的分类结果与其资源来源地分类结果并不完全一致，分析可能是清远本土茶树资源在清远市域内自然杂交和引种频繁，导致区域内部茶树群体种相互混杂。从分布地域来看，清新区的遗传多样性水平最高，阳山县次之，英德市最低；
8 个县（市、区）的Ho 均小于He，即存在纯合子偏多的现象，其中英德市最接近于平衡状态，阳山县最远离平衡状态。同时，清新区、阳山县的遗传多样性水平相对丰富，具有足够的更新能力，但阳山县的近交程度最高，这也说明，部分群体可能具有较高的遗传多样性，但由于近交增加，可能导致群体衰退，所以，可以考虑创造更多的条件使群体内充分异交，以维持群体较高的遗传多样性。英德市的近交程度最低，但遗传多样性水平也最低，因此，也可以考虑创造条件增加群体异交，以提高群体遗传多样性。总体来说，清远野生茶树资源间的遗传差异较大，遗传基础较宽，具有比较丰富的遗传多样性。这为今后进一步挖掘、利用清远野生茶树种质资源，筛选培育茶树新品种，开发茶叶新产品提供参考。
