丁云录，杨 明，申巧慧，李驰坤，李晓兵，欧喜燕，冷 炎*
（1.长春中医药大学附属医院，长春 130021；
2.长春中医药大学中医学院博士研究生，长春 130117 ）
非酒精性单纯性脂肪肝（NAFL）是近年肝病领域研究的重点之一。绝经后女性因雌激素水平下降，发病率逐年增高，但针对性的治疗药物，中西医目前均为空白。本实验课题在院内制剂养肝解郁颗粒前期实验和临床研究基础上设计实验，进行养肝解郁颗粒治疗绝经后非酒精性单纯性脂肪肝的药效学及相关机制研究，为临床应用提供药理学依据。
1.1 实验材料 动物购入SPF 级Wistar 大鼠，雌性，220～250 g。动物合格证号：SCXK-（吉）2018-0007，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。药品养肝解郁颗粒，规格：每袋11 g，批号：20191101，由长春中医药大学附属医院实验研究中心提供。水飞蓟宾胶囊，规格：35 mg×30 粒/盒，批号：050711064，天津天士力圣特制药有限公司产品。丙硫氧嘧啶片，规格：50 mg×100 片/瓶，批号：1719590，有效期至2022.10.18，Lomapham Rudolf Lohmann GmbH KG Gemany。试剂二氧化乙烯基环己烯（VCD）溶液，规格：每瓶25 g，批号：C11609597、芝麻油，规格：每瓶250 mL，批号：C11822050、胆固醇，规格：每瓶25 g，批号：C11609597，上海麦克林生化科技有限公司。蛋黄粉，规格：每瓶100 g，批号：Z06A11X120668，上海源叶生物科技有限公司。AST 测定试剂盒，规格：R1：10 mL×10，R2：100 mL×1/盒，批号：191381、ALT 测定试剂盒，规格：R1：10 mL×10，R2：100 mL×1/盒，批号：202751、TC 测定试剂盒，规格：R1：10 mL×10，R2：100 mL×1/盒，批号：192061、TG 测定试剂盒，规格：R1：100 mL×1，R2：10 mL×10/盒，批号：198021，均为中生北控生物科技股份有限公司。MDA 测试盒，规格：每盒50 T，批号：20201019，南京建成生物工程研究所。SOD 测试盒，规格：每盒50 T，批号：20201019，南京建成生物工程研究所。FFA 测试盒，规格：每盒50 T，批号：20201014，南京建成生物工程研究所。E2 试剂盒，规格：每盒48 T，批号：20201028-30267A、FSH 试剂盒，规格：每盒48 T，批号：20201028-30274A、LH试剂盒，规格：每盒48 T，批号：20201028-30447A，黄石研科生物科技有限公司。仪器酶标仪，型号：BIO680，Japan BIO RAD 公司；
全自动分析仪，型号：selectra junior，荷兰威图公司；
高速冷冻离心机，型号：Biofuge Stratos，德国贺利氏公司；
可调高速匀浆器，型号：FSH-2，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；
电热恒温鼓风干燥箱，型号：OHG-914385-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司；
生物组织脱水机，型号：ZT-14V2；
石蜡包埋机，型号：YB-6LF；
摊片机，型号：YT-7FB；
染色机，型号：YR-21，湖北亚光；
切片机，型号：leica2255；
冷台，型号：leicaEG 1150C，德国徕卡。-80℃冰箱，型号：ULT1386-3-V41，Thermo Fisher Scientific（Asheville）LLC。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 将70 只Wistar 健康雌性大鼠进行适应性喂养1 周后，称重，按体质量大小编号，通过随机数字表，将实验大鼠随机分为空白对照组（15 只）；
绝经模型组（55 只）。
建立雌性大鼠绝经后动物模型（去氧乙烯基环乙烯腹腔注射法）[1-6]。
绝经模型组大鼠给予15 d 腹腔注射质量浓度为80 mg/kg 去氧乙烯基环乙烯（VCD）溶液（以芝麻油为溶媒）2.5 mL/（kg·d），空白组给予腹腔注射15 d同等剂量芝麻油2.5 mL/（kg·d）。15 d 后模型组和空白组随机麻醉5 只大鼠，腹主动脉取血，4 ℃离心后，检测血清雌二醇（E2），卵泡刺激素（FSH），促黄体生成素（LH）。模型制备成功后，可见血清E2水平降低，血清FSH、LH 水平升高。
1.2.3 高脂高糖复合因素法制备非酒精性单纯性脂肪肝模型[7-11]将围绝经期模型成功的大鼠，随机分为空白对照组，模型组，阳性对照组，养肝解郁颗粒高、中、低3 个剂量组，共6 组，每组10 只。模型组及各给药组给予高脂高糖饲料饮食，高脂高糖饲料由猪油（10%）、胆固醇（2%）、蛋黄粉（5%）、丙硫氧嘧啶（0.2%）、蔗糖（10%）、基础饲料（72.8%）组成。持续造模及灌胃养肝解郁颗粒8 周。对照组给予正常饮食。大鼠在实验过程中自由摄食，自由饮水，每周称量体质量1 次，根据体质量调整给药体积。
1.2.4 给药方法 阳性对照药水飞蓟宾胶囊大鼠药效剂量75 mg/kg；
养肝解郁颗粒设6.0、3.0、1.5 g/kg 给药剂量，受试药物用蒸馏水配制成混悬液，每日灌胃给药1 次，正常对照组与模型对照组大鼠灌胃等量的蒸馏水，灌胃体积为10 mL/（kg·d）。试验过程中大鼠自由摄食饮水，每周称量体质量1 次，以调整给药剂量。造模同时给予受试药物，给药周期12 周。
1.2.5 检测指标 养肝解郁颗粒灌胃8 周末，禁食不禁水12 h，乌来糖麻醉，腹主动脉取血，静置30 min，3 000 r/min 离心15 min，分离血清。血清生化指标的检测，检测AST、ALT、TC、TG 水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。动物处死后，迅速取出肝脏，预冷的生理盐水冲洗肝脏，擦干后称取质量，计算肝系数。肝系数＝肝脏质量/体质量×100。取距肝大叶边缘5 mm 处的肝组织置于10%的甲醛溶液中固定，HE染色，供组织病理学检查；
另剪取一块肝组织于冰0.9%氯化钠溶液中漂洗除去血液，滤纸吸干，称取0.5 g，一块放入玻璃匀浆管，加5 mL 冰0.9%氯化钠，用匀浆机10 000～15 000 r/min上下研磨制备10%组织匀浆，用于检测肝组织中TC、TG、MDA、SOD、FFA 含量，操作严格按照试剂盒说明书进行。
肝细胞脂肪变性评分标准：无肝细胞脂肪变性，0级，0 分；
偶见肝细胞脂肪变性，Ⅰ级，1 分；
灶状肝细胞脂肪变性，占肝细胞总数1/3 以内，Ⅱ级，2 分；
脂肪变性肝细胞占1/3 以上，Ⅲ级，3 分；
肝细胞弥漫脂变，Ⅳ级，4 分。
1.3 统计学处理 试验结果以均数±标准差（±s）表示，统计学处理方法采用组间t检验。
2.1 对大鼠肝组织匀浆中TC、TG 含量及肝脏系数的影响 见表1。
表1 养肝解郁颗粒对绝经后NAFL 雌性大鼠肝组织匀浆中TC、TG 含量及肝脏系数的影响（± s，n =10）
表1 养肝解郁颗粒对绝经后NAFL 雌性大鼠肝组织匀浆中TC、TG 含量及肝脏系数的影响（± s，n =10）
注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01
2.2 对大鼠血清ALT、AST 活性及TC、TG 含量的影响 见表2。
表2 养肝解郁颗粒对绝经后NAFL 雌性大鼠血清ALT、AST 活性及TC、TG 含量的的影响（± s，n =10）
表2 养肝解郁颗粒对绝经后NAFL 雌性大鼠血清ALT、AST 活性及TC、TG 含量的的影响（± s，n =10）
注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01
2.3 对大鼠肝组织匀浆中MDA、FFA 含量及SOD 活性的影响 见表3。
表3 养肝解郁颗粒对绝经后非酒精性单纯性脂肪肝雌性大鼠肝组织匀浆中MDA、FFA 含量及SOD 活性的影响（± s，n =10）
表3 养肝解郁颗粒对绝经后非酒精性单纯性脂肪肝雌性大鼠肝组织匀浆中MDA、FFA 含量及SOD 活性的影响（± s，n =10）
注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01
2.4 对肝脏病理组织学改变的影响 正常对照组大鼠的肝内可见多个肝小叶，肝索及肝窦排列整齐，汇管区3 种管道结构清楚可见，无明显异常，呈正常肝组织结构。模型组肝细胞可见明显的脂肪变性。证明肝损伤的模型复制是成功的。阳性药物组肝细胞可见脂肪变性；
肝细胞未见点状坏死；
未见炎细胞浸润。与模型组比较，阳性药物组肝损伤程度减轻，有效缓解肝细胞脂肪变性。高剂量组肝细胞脂肪变性程度减轻，未见肝细胞坏死，未见炎细胞浸润；
与模型组比较，高剂量组可以有效减轻肝损伤的程度，与阳性药物组比较，高剂量组效果优于阳性药物组。中剂量组肝细胞以脂肪变性为主，未见肝细胞坏死，未见炎细胞浸润；
与模型组比较，中剂量组可以有效减轻肝细胞脂肪变性的程度。低剂量组肝细胞脂肪变性的程度得到有效的减轻，未见肝细胞坏死，未见炎细胞浸润；
与模型组比较，低剂量组可以有效减轻肝细胞脂肪变性的程度。见肝脏病理照片1～6 及表4、5。
表4 养肝解郁颗粒对绝经后非酒精性单纯性脂肪肝雌性大鼠肝脏的病理形态影响观察结果
图1 正常对照组大鼠肝脏病理照片
图2 模型对照组大鼠肝脏病理照片
图3 阳性对照组大鼠肝脏病理照片
图4 养肝解郁颗粒高剂量组大鼠肝脏病理照片
图5 养肝解郁颗粒中剂量组大鼠肝脏病理照片
图6 养肝解郁颗粒低剂量组大鼠肝脏病理照片
表5 养肝解郁颗粒对绝经后非酒精性单纯性脂肪肝雌性大鼠肝细胞脂肪变性评分统计（± s）
表5 养肝解郁颗粒对绝经后非酒精性单纯性脂肪肝雌性大鼠肝细胞脂肪变性评分统计（± s）
注：与模型对照组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01
非酒精性单纯性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）是非酒精性脂肪肝病（NAFLD）早期阶段，也是相对易控制治疗的时期，在此时对疾病进行干预，可以降低继而发展为非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化的风险，能有效的减少非酒精性脂肪肝病的发病率[12-14]。绝经后女性因雌激素降低引起机体脂代谢功能紊乱，导致肥胖及高脂血症，与非酒精性单纯性脂肪肝的发生密切相关，非酒精性单纯性脂肪肝在我国成人中发病率较高，患病率绝经后女性高于男性[15-16]。非酒精性单纯性脂肪肝发病初期，TG 在肝细胞累积成脂滴，形成肝脏脂肪变性，影响脂质代谢，主要表现为 TC、TG 异常升高。随着肝脏 TG 的继续累积，过量的脂肪酸聚集在肝脏引起肝脏损伤，表现为 ALT、AST 的异常升高，肝细胞脂肪变性，同时机体抗氧化能力减弱，即SOD 活性下降，FFA、MDA 含量升高，进一步导致肝脏内脂质过氧化损伤[17-19]。
养肝解郁颗粒方来源于丹栀逍遥散加决明子而成，具有疏肝清热、健脾养血之功效。主治非酒精性脂肪性肝病，中医辨证属肝郁脾虚、内有郁热型。症见胁肋不舒，烦躁易怒，自汗盗汗、潮热、头痛目赤、面赤口干、月经不调等证。在本实验中，绝经期大鼠非酒精性单纯性脂肪肝模型建立成功后，模型组大鼠肝细胞可见明显的脂肪变性，肝组织匀浆中TC、TG 含量及肝脏系数均明显升高，血清AST、ALT 活性及TC、TG 含量均明显升高，大鼠肝组织匀浆中MDA、FFA 含量显著升高、SOD 活性显著降低。在给予养肝解郁颗粒药物干预后，均有不同程度的减轻，能减缓非酒精性单纯性脂肪肝的进展，可作为治疗非酒精性单纯性脂肪肝的有效中药制剂。
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