汤 雯，许 勇，尚莉丽
(1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230012；
2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031)
小儿急性上呼吸道感染(acute upper respiratory infection in children，AURIC)系由各种病原体引起的上呼吸道的急性感染，是小儿常见的急性感染性疾病，冬春时节发病率高[1-2]。西医主要采用解热、镇痛、镇咳、祛痰等对症治疗，中医药治疗本病具有病程短、疗效快，安全性高和不良反应小等优势[3]。AURIC相当于中医学“感冒”，病因病机为感受风邪，导致卫表失和、肺气失宣。临床上主要辨证为风寒、风热、暑邪及时邪等，并且具有夹痰、夹滞、夹惊等兼证。总的治疗方法为疏风解表[4]。小儿病毒性心肌炎(viral myocarditis in children，VMC)是以局限性或弥漫性心肌炎症病变为病理改变的心血管疾病，通常为病毒侵犯心肌所致[1]。VMC在中医学中没有特定的病名，可将其归于“心悸”“怔忡”“风温”等范畴[5]。风热犯心、湿热侵心、气阴亏损、心阳虚衰、痰瘀阻络等为其主要中医辨证分型[4]。柯萨奇病毒、埃可病毒、腮腺炎病毒及流行性感冒病毒等20种病毒既可导致上呼吸道感染又可引起VMC[6]。
金银花、连翘、荆芥穗、淡豆豉、桔梗、牛蒡子、竹叶、甘草、薄荷、芦根等组成的银翘散出自清代吴鞠通的《温病条辨》，该方具有疏风散热、辛凉透表、清热解毒之功效[7]。《中医儿科学》[4]首选银翘散加减治疗风热型小儿AURIC及风热犯心型小儿VMC。钱厚聪[8]研究发现，银翘散配合西药治疗能提高小儿AURIC的疗效；
代雪丽等[9]运用Meta分析方法对银翘散联合常规西药治疗VMC患者的临床疗效进行分析，发现银翘散联合常规西药的疗效较常规西药更好。
本研究通过网络药理学及分子对接技术探讨银翘散“异病同治”治疗AURIC、VMC的机制，并验证中医辨证论治思想“异病同治”的现代科学性。
1.1 银翘散活性成分筛选及其靶点获取 依次将银翘散的组方药物金银花、桔梗、薄荷、淡豆豉、连翘、牛蒡子、荆芥穗、甘草、芦根、竹叶10味中药输入TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)并运用CNKI数据库核查，再根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性指数(drug likeness，DL)≥0.18作为标准筛选确定复方活性成分。最后利用TCMSP数据库对活性成分进行靶点预测，并使用UniProt数据库(https://www.uniprot.org)规范靶点对应标准基因名。
1.2 银翘散与AURIC、VMC的交集靶点获取 以“Acute upper respiratory infection in children”“Viral myocarditis in children”为关键词，分别输入GeneCards数据库(https://www.genecards.org)及OMIM数据库(https://omim.org)检索AURIC及VMC的靶点，删除重复靶点后，使用Venny在线分析工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)获得银翘散与AURIC、VMC的交集靶点。
1.3 “银翘散—成分—靶点”网络构建 将银翘散与AURIC、VMC的交集靶点同活性成分输入Cytoscape 3.9.1软件，利用Analyze Network功能进行拓扑分析，计算度值及介数中心性，并以节点度值大小为主要依据构建“银翘散—成分—靶点”网络。
1.4 银翘散与AURIC、VMC交集靶点PPI网络构建及核心靶点分析 将银翘散与AURIC、VMC的交集靶点上传至STRING数据库(http://string-db.org)，获得PPI网络。将PPI网络导入Cytoscape 3.9.1软件，利用Analyze Network功能对靶基因进行拓扑分析，然后使用其CytoHubba插件，筛选度值排名前5的靶点，作为潜在作用靶点，进行后续分析。
1.5 GO功能和KEGG通路富集分析 将银翘散与AURIC、VMC的交集靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)进行GO功能富集及KEGG通路富集分析。将分析结果按照P值由小到大进行排列，最后进行可视化分析。
1.6 分子对接 选取PPI网络中度值排名前5位的潜在作用靶点作为受体大蛋白，从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)找其对应靶蛋白的3D结构模式；
取“银翘散—成分—靶点”网络中重点活性成分作为配体小分子，从TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)中下载其结构模式。利用PyMOL软件对受体大蛋白进行去水、去小分子配体等操作，使用AutoDock 4.4.6软件计算受体蛋白和配体小分子蛋白质结构的电荷，搜索配体分子的可旋转化学键等操作，设定合适的对接盒子及对接参数，设定对接形式为半柔性对接，配体分子设置为柔性，依次进行分子对接；
最后利用PyMOL软件进行可视化分析。
2.1 银翘散活性成分筛选及其靶点获取 参照TCMSP数据库和CNKI数据库，再依据OB值及DL值进行筛选，最终确定金银花活性成分23个、桔梗活性成分7个、薄荷活性成分10个、淡豆豉活性成分2个、连翘活性成分23个、牛蒡子活性成分8个、荆芥穗活性成分8个、甘草活性成分92个、芦根活性成分1个、竹叶活性成分2个，删除无对应靶点的活性成分及重复项，最终获得银翘散活性成分129个，OB值前30位活性成分见表1。去除重复并校对后得到264个作用靶点。
表1 银翘散OB值前30位活性成分
2.2 银翘散与AURIC、VMC的交集靶点获取 通过对GeneCards数据库和OMIM数据库检索并删除重复靶点后，获得小儿AURIC 8 652个靶点、小儿VMC 3 748个靶点，使用Venny在线分析工具，获得银翘散与AURIC、VMC的交集靶点119个，见图1、表2。
表2 银翘散与AURIC、VMC的交集靶点
图1 银翘散与AURIC、VMC交集靶点韦恩图
2.3 “银翘散—成分—靶点”网络构建 根据“2.1”“2.2”结果，将银翘散药物、活性成分与AURIC、VMC交集靶点构建“银翘散—成分—靶点”网络，结果包括154个节点和483条边，节点分别为119个交集靶点、10种药物和25种活性成分。关联靶点数前5位活性成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、豆甾醇；
其中槲皮素关联靶点数最多，为33个。“银翘散—成分—靶点”网络见图2，前5位活性成分见表3。
表3 前5位活性成分
2.4 银翘散与AURIC、VMC交集靶点PPI网络构建及核心靶点分析 通过STRING数据库，设置蛋白相互作用可信度≥0.900，获得包含119个节点和466条边的PPI网络(见图3)，其中孤立靶点11个。将该网络以TSV格式导入Cytoscape 3.9.1进行拓扑分析后获得一个具有103个节点、463条边的核心网络(见图2)。
图2 银翘散—成分—靶点图
图3 PPI网络图
利用Analyze Network功能计算各靶点度值，得到排在前5位的靶点分别是STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1。度值前25位的靶点及其拓扑分析结果见图4、表4。
注：节点大小、颜色深浅、透明度代表度值大小，边粗细及透明度代表靶点关联性强弱
2.5 GO功能和KEGG通路富集分析
2.5.1 GO功能富集分析 对银翘散与AURIC、VMC交集靶点进行GO功能富集分析，结果提示共同靶点GO富集分析涉及684条(P<0.05)，其中主要影响生物过程的有533条，主要包括基因表达的调控、凋亡过程的调控、激素的调控、代谢产物的调控、衰老等生物过程；
细胞的组成有57条，主要包括细胞外空间、大分子络合物、血小板α颗粒腔、核质、细胞质核周区、质膜的组成部分、细胞外基质等；
分子功能有94条，主要包括酶结合、蛋白结合、整合素结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、配体激活序列特异性DNA结合等。根据P值，分别取排名前20位绘制结果图，见图5。
图5 GO功能富集柱状图
2.5.2 KEGG通路分析 对银翘散与AURIC、VMC交集靶点进行KEGG通路富集分析，结果示共同靶点所富集的通路为144条(P<0.05)，包括癌症信号通路、PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路、AGE/RAGE信号、IL-17信号通路等，根据P值，取排名前50的通路绘制结果图，见图6。
图6 KEGG通路富集结果分类图
2.6 分子对接 由“2.3”分析结果可知，排名前5的重要成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、豆甾醇；
由“2.4”分析结果可知，度值前5位的核心靶蛋白分别为STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1。运用AutoDock 4.4.6软件对核心靶点与重点活性成分进行分子对接，结果各靶点与活性成分的对接结合能均小于0 kcal/mol，分子对接结果见表5。利用PyMOL软件对STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1与槲皮素进行可视化分析，结果见图7。
注:A.AKT1-槲皮素;B.MAPK3-槲皮素;C.RELA-槲皮素;D.STAT3-槲皮素;E.TNF-槲皮素
表5 分子对接结合能
“异病同治”作为中医辨证论治的重要思想之一，在《黄帝内经》中就有体现，在张仲景的《伤寒论》中更有充分体现[10]。陈士铎《石室秘录》首次提出“异病同治”这一概念[11]。“异病同治”系不同疾病在不同阶段出现相同的病机变化，即出现相同的证候表现时，采用相同的治疗方法，为中医“辨病”“辨证”核心思想的体现，是中医学的重要治疗原则[12]。AURIC、VMC从中医学的角度出发，二者均为感受外邪，同时可夹有寒、热、湿、毒等。小儿肺常不足，外感邪气之后，首犯肺卫导致卫表失和、肺气失宣，导致AURIC；
若外邪入里，可致心脉痹阻、心血不畅，导致小儿VMC。银翘散具有辛凉解表、疏风清热、清热解毒之功，可治风热之AURIC、风热动风之VMC。
本研究采用网络药理学及分子对接技术，从银翘散治疗AURIC、VMC的共同靶点出发，分析其核心靶点及通路，并以此验证“异病同治”的科学性。
根据“银翘散—活性成分—靶点”网络的构建，发现银翘散与AURIC、VMC之间关联靶点数最多的活性成分为槲皮素。槲皮素通常以槲皮素糖苷的形式存在，是一种低相对分子质量的多酚类植物化学物质；
也是一种生物类黄酮，具有抗病毒、抗炎、抗癌、抗氧化、抗高血压病、抗阿尔茨海默病、保护神经、保护心血管等作用[13]。槲皮素作为抗病毒药物的潜在用途，能够在初期抑制病毒感染，与病毒复制的蛋白酶相互作用，并减少感染引起的炎症[14]。杜丽娜等[15]发现槲皮素具有抗呼吸道系统病毒的作用，如抗流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒。韦迎娜等[16]通过动物实验证明，槲皮素可减轻新生小鼠VMC氧化应激损伤和炎症反应。同时杨青丽等[17]研究发现，槲皮素可以促进神经再生，发挥脑保护作用。
通过分析交集靶点的PPI网络，得出STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1等是银翘散治疗AURIC、VMC的潜在核心靶点。STAT3属于STAT蛋白质亚型之一，是JAK激酶的下游靶蛋白，在调节炎症基因活性和细胞因子的信号传导中具有关键作用。研究[18]表明，STAT3活性增强可以促进气道平滑肌细胞的增殖，对治疗小儿AURIC起到一定作用。TNF常指TNF-α，由内皮细胞、肥大细胞、单核吞噬细胞所分泌，具有双重作用，适量的TNF具有抗感染、抗病毒等作用，过量的TNF则会增强微血管壁通透性，改变黏膜血管内皮细胞反应，诱导凝血酶形成，形成局部微血栓；
同时可活化单核细胞、巨噬细胞，增强NK细胞毒性，诱导IL-6细胞因子分泌[19]。TNF与VMC的心肌病变有关，对心肌造成损伤，同时通过激活NF-κB信号通路促进炎症因子的释放[20-21]。闫树丽[22]通过动物实验验证了银翘散可降低TNF-α的表达水平从而抑制炎症反应。AKT是PI3K主要下游靶标，由AKT1、AKT2和AKT3 3种亚型组成，其中AKT1含量最丰富，多在脑、心脏和肺等器官中，通过磷酸化激活或抑制其下游靶蛋白，发挥抑制细胞凋亡、促进细胞存活的作用[23]。同时其余靶点如IL-6，也是银翘散对AURIC、VMC的作用靶点。
GO功能和KEGG通路分析显示，银翘散的功能主要涉及基因表达的调控、凋亡过程的调控、激素的调控、代谢产物的调控、对药物的反应等生物过程；
通路主要富集在癌症、PI3K/Akt信号通路、TNF信号通路、AGE/RAGE信号、IL-17信号通路及Toll样受体信号通路等。PI3K/AKT通路是重要的促增殖及抗凋亡信号通路之一，直接调控、影响相关转录因子的活性及抑制线粒体凋亡因子来抗细胞凋亡，可控制心肌细胞存活及功能，调控心肌细胞存活和程序性死亡，同时也可调节机体的免疫功能[24-26]。TNF信号通路同样参与细胞的增殖、生长、免疫应答及炎症反应，促进IL-6、TNF-α等炎症因子释放，诱导炎症反应[27-29]。AGE/RAGE信号通路通过激活NADPH氧化酶，产生活性氧，来活化NF-κB，继之释放TNF-α、IL-1等炎症因子及黏附因子，参与炎症反应[30]。IL-17信号通路是参与机体炎症反应的经典促炎通路[31]，IL-17可以作用于VMC患者，从而提高心脏功能和免疫功能[32]。Toll样受体是在树突状细胞、支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞上均有所表达的病原微生物的主要识别受体，通过刺激T淋巴细胞增殖，参与急性上呼吸道炎症反应的病理生理过程；
同时激活NF-κB，从而介导免疫反应[33-34]。
通过分子对接分析发现，银翘散与AURIC、VMC交集核心靶点STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1与重要活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、豆甾醇均有较强的结合活性，表明银翘散治疗AURIC、VMC的核心靶点与重要活性成分也有良好的亲和力，从一定程度上证实银翘散“异病同治”的作用是通过这些核心靶点实现的。
综上所述，本研究利用网络药理学及分子对接技术从蛋白与通路层面分析银翘散“异病同治”AURIC、VMC的机制，发现银翘散通过槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、豆甾醇等活性成分，STAT3、RELA、TNF、MAPK3、AKT1等靶点以及癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路及Toll样受体信号通路等途径对AURIC、VMC发挥作用，且分子对接可表明关键靶点与重点活性成分有良好的亲和力。本研究仅从生物信息学角度进行剖析，今后可以从体内外实验进一步验证银翘散“异病同治”AURIC、VMC的机制。
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