郭兆宽，王益娜，李志远，冯孝林，陈 庚，舒彦宇，张广辉，郝 冰，杨生超*
1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201；
2.云南农业大学西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，云南昆明 650201；
3.云南特色植物提取实验室，云南昆明，650106
葫芦素（cucurbitacins）是一类以葫芦烷为骨架的四环三萜类化合物，主要存在于葫芦科植物中[1]，具有显著的抗癌活性[2-5]。葫芦科植物罗汉果（Siraitia grosvenori）中的一些葫芦烷糖苷（罗汉果苷）有很强的甜味，是糖尿病患者的潜在糖类替代品[6]。解析葫芦素和葫芦烷糖苷的生物合成途径，对于瓜类作物育种、葫芦素单体和罗汉果苷的生物合成具有重要意义。
葫芦素与绝大多数植物三萜类化合物相似，植物体内的三萜化合物骨架的生物合成始于甲羟戊酸途径，代谢途径是以乙酰辅酶A（acetyl-CoA）为起始原料合成异戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲烯丙基焦磷酸（DMAPP）。这类代谢产物在一系列催化酶的催化作用下形成 2,3-氧化角鲨烯（2,3-oxidosqualene），即四环三萜化合物的前体物质（图1）。通常情况下大多数四环三萜化合物的基本碳骨架都由一类氧化鲨烯环化酶家族催化2,3-氧化角鲨烯的船式或椅式构象形成[7]。研究表明，葫芦素生物合成起始于 2,3-氧化鲨烯环化形成的葫芦二烯醇（Cuol），是由氧化鲨烯环化酶（OSCs）家族的葫芦二烯醇合酶（CBS）催化[8-10]。在大多数情况下，OSC催化形成的四环三萜骨架在细胞色素P450的催化下，通过引入羟基、羧基进行特定部位的氧化修饰，从而衍生出更多的终产物和中间体。前人研究发现甜瓜中葫芦素B和西瓜中葫芦素E的多功能CYP87D20连续不断地催化Cuol的C11氧化和C20位羟化，形成11-羰基-20β-羟基-Cuol（11-carbonyl-20β-hydroxy-Cuol），接下来CYP81Q59催化其C2位的β羟化，形成11-羰基-2,20β-二羟基-Cuol[8-9]（11-carbonyl-2,20β-dihydroxy-Cuol）（图1）。
图1 葫芦素中间体的生物合成路径Fig.1 Biosynthetic pathway of cucurbitacin intermediates
雪胆中的雪胆素（包括葫芦素 IIa和葫芦素IIb）属于典型的葫芦素F（cucubitacin F），其葫芦烷型骨架的 C3-羟基为 α型（图2）[10]，这是葫芦素F的典型结构特点之一。同时葫芦素F与其他葫芦素结构中有许多相同修饰基团，比如葫芦素B（cucubitacin B）和E（cucubitacin E）的C11氧化，C20位羟化以及C2位的β羟化与葫芦素F共性；
葫芦素B、E与F在C25位羟基化修饰后，然后再酰基化，还有C22的酮基化和C16的 α-羟基化。因此，亟待解析雪胆葫芦素 B、E和F生物合成途径过程以及挖掘其他CYP450基因，推进葫芦素全合成尤为重要。
图2 葫芦素F分子结构（A）和六年生雪胆块茎（B）Fig.2 Molecular structure of cucurbitacin F (A) and six-year-old Hemsleya chinensis Cogn.tuber (B)
葫芦素这类化合物高度被氧化，在植物中的含量较低同时其利用也受到限制，提取纯化工艺复杂且耗时，需投入大量的人力、物力等资源，如前人曾从375 kg黄瓜叶片中分离到480 mg缺乙酰基葫芦素 C，用于体外实验来研究葫芦素生物合成的关键酶基因功能，巨大的材料投入和工作量令人望而生畏[11]。目前，相关药物的开发中，主要通过从植物中提取的方式来制备。要实现对葫芦素的化学合成仍存在诸多挑战，特别是葫芦素关键中间体化合物。随着合成生物学和代谢工程的发展，为葫芦素中间体高效异源合成提供了新的契机，农杆菌渗入法（agro-infiltration）即根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的瞬时表达是一种高效的生产植物三萜的合成生物平台[12-14]，也是一种快速鉴定和发现三萜生物合成相关基因并验证功能的有效方法[15-18]。本研究尝试将前期鉴定的雪胆（Hemsleya chinensisCogn.）的CBS同源基因（HcOSC6）和HcCYP87D20基因表达于本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中，获得葫芦素生物合成中间体11-羰基-20β-羟基-葫芦二烯醇，本研究结果将为葫芦素B、E、F的合成奠定基础。
1.1 材料
1.1.1 植物材料和菌种 本氏烟草种子由本实验室保存。携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒pAN580（pAN580-GFP）购自武汉天问生物科技有限公司。瞬时表达载体pEAQ-HT-DEST1由东北林业大学薛哲勇教授惠赠。大肠杆菌 DH5α、根癌农杆菌菌株 GV3101、EHA105和 LAB4404感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。
1.1.2 仪器与试剂 RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自天根生化科技有限公司（北京），Q5®High-Fidelity DNA Polymerase购自NEB有限公司，EasyPure Quick Gel Extraction Kit，2×EasTaqPCR Mix 购自北京全式金生物技术股份有限公司，2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES)、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）购自昆明傲雪商贸有限公司，Gateway entry clone（ALH328）试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司。
凝胶成像系统仪（Protein Simple）；
带有蓝色激发光的 LSM710共聚焦激光显微镜（Carl Zeiss, Inc., Jena，德国）；
NanoReady超微量紫外可见分光光度计，安捷伦1260高效液相色谱仪，真空渗透仪（DGG-9000B系列），氮吹仪（MD200-1A）。
1.2 方法
1.2.1 培养烟草 本氏烟草种子用 2%次氯酸钠表面消毒后，播种于1/2MS培养基上。待出芽后，室温放置1~2 d，移栽到填充腐殖土的蔬菜育苗穴盘上。置于人工气候室（25℃，相对湿度80%，18 h光照，6 h黑暗），生长5周后用于农杆菌渗入。
1.2.2 载体构建 为快速判断外源基因是否在本氏烟草叶片中表达及细胞中的表达部位，构建了携带GFP基因的pEAQ-HT-DEST1-GFP载体，同时以pAN580-GFP载体[19]作为外源基因表达的亚细胞定位的阳性对照。利用引物GFP-F和GFP-R，从pAN580-GFP上扩增出GFP的编码序列并克隆雪胆的HcOSC6和HcCYP87D20基因。前人研究表明，截短的 3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶 A还原酶基因（tHMGR）与 β-香树脂醇（SAD1）和CYP51H10共表达，能够显著提高烟草瞬时表达系统的三萜产量[12]，因此也克隆了糙伏毛燕麦（Avena strigosa）HMGR基因（GenBank登录号：KY284573）截短的417个核苷酸的部分（tHMGR）。
将扩增到的GFP、HcOSC6、HcCYP87D20和tHMGR基因切胶回收，使用 Gateway entry clone试剂盒BP克隆酶II混合物（Invitrogen）将胶回收产物克隆到pDONR207载体中。所构建体均在 Entry载体中测序，以验证克隆的完整性，根据制造商的说明，使用 LR克隆酶 II将相关的Entry载体中的基因克隆到pEAQ-HT-DEST1中。构建成功的 pEAQ-HT-DEST1-GFP、pEAQ-HTDEST1-HcOSC6、pEAQ-HT-DEST1-HcCYP87D20和 pEAQ-HT-DEST1-tHMGR重组质粒以及载体pAN580-GFP通过冻融法转化到农杆菌感受态细胞里。
1.2.3 本氏烟草的农杆菌渗入 挑取构建好的工程菌单菌落在添加LB（50 mg/mL Kan+ 50 mg/mL Rif）液体培养基中，28℃ 220 r/min培养24 h。从中吸取200 μL加入含有上述新鲜培养基50 mL中，继代培养至OD600达2.0左右时以5000 r/min离心5 min，收集菌体，用含10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和100 μmol/L乙酰丁香酮的缓冲液重悬菌体，于 250 mL配置成不同浓度菌液（OD600分别为 0.4、0.6、0.8、1.0），放置在渗透槽中，将整株烟草浸没在农杆菌液中，在不同真空压力（40、60、80、100 kPa），以5周龄的烟草作为植物材料，真空渗透时间为 3 min，4 d后采收烟草叶片，取 100 mg烟草叶片提取总RNA，反转录合成cDNA，并稀释至200 ng/μL，以此为模板进行半定量PCR以评价各因素对转化效率的影响。半定量PCR使用编码GFP基因上的特异引物P-GFP-F和P-GFP-R，使用延伸因子1a（EF1a）[20]作为烟草内参基因，使用 Image J软件对核酸凝胶GFP目的条带进行灰度值分析。使用特异性引物见表1。
表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study
1.2.4 烟草中的葫芦二烯醇的提取分析 温室培养4 d后收获烟草叶片，提取代谢物进行GC-MS分析。取1.0 g干燥叶片于液氮中冷冻后研磨成细粉，用5 mL正己烷重复提取3次，37℃下孵育1 h，之后超声提取20 min。再用正己烷∶乙酸乙酯混合液（4∶1,V/V）提取一次，提取物短暂涡旋后以5000 r/min离心10 min，取60 μL上清液到玻璃小瓶中，用氮吹仪吹干浓缩。浓缩的提取物置于玻璃小瓶中，加40 μL三甲基甲硅烷基氰化物（TMSCN）衍生化。加入TMSCN后，将样品转移到MPS的搅拌器中，并在40℃下孵育40 min。衍生化后的干燥样品重悬于200 µL萃取溶剂中，即用 1 mL正己烷重新溶解，然后吸取每个样品1 μL直接进样到ISQ型质谱联用的GC超气相色谱仪安捷伦中检测。以不分流模式（脉冲压力30 psi）注入1 µL样品（进样口250℃），该程序涉及2 min的柱箱温度170℃，以20℃/min的速度升至300℃。在300℃下保持11.5 min。溶剂延迟8 min后，以扫描模式（60~800质量单位）进行检测。使用MassHunter工作站（Agilent）软件进行数据分析。
1.2.5 HPLC检测方法 测定定量葫芦二烯醇的含量，在不同浓度下分别注入配好的葫芦二烯醇标准品溶液，采用 Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm, 2.7 μm）色谱柱，流动相为2%纯水（A），98%乙腈溶液（B），等度洗脱 0~26 min，98% B；
检测波长为200 nm，进样体积10 μL，流速0.8 mL/min，柱温为40℃。以5个浓度不同的对照品为横坐标，所对应的峰面积为纵坐标绘制对照品标准曲线，用于含量测定。
1.2.6 UPLC-ESI-qTOF-MS 分析 11-羰基-20β-羟基-Cuol 取 200 mg烟草叶片于液氮中冷冻后研磨成细粉，用1 mL乙酸乙酯重复提取3次，37℃下孵育1 h，合并萃取液，用氮吹仪浓缩干。浓缩物加入200 µL色谱甲醇溶解，并用0.22 µm微孔滤膜过滤，然后采用UPLC-ESI-qTOF-MS（Agilent 1290，四级杆串联飞行时间质谱Agilent 6540）进行检测，检测条件：色谱柱Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×100 mm, 2.7 µm），进样量 2 µL，流速0.8 mL/min。流动相是0.1%甲酸（A相）和乙腈（B相），采用线性梯度洗脱程序，时间及B相的比例如下：0 min，30%；
16 min，100%；
23 min，100%；
28 min，100%。质谱条件：离子源采用是正离子模式，气体温度 350℃，喷雾电压500 V；
碎裂电压140 V；
锥孔电压60 V；
射频电压750 V，扫描范围50~1000m/z。
2.1 农杆菌瞬时表达体系的构建
携带pEAQ-HT-DEST1-GFP载体和pAN580-GFP农杆菌菌液，在OD600=0.8，真空压力80 kPa条件下，农杆菌渗入5周龄烟草幼苗，96 h后激光共聚焦显微镜观察叶片中报告基因GFP的表达部位。发现2个载体农杆菌菌液渗入处理后，细胞质、细胞核、细胞膜中均能观察到GFP的表达（图3），表明构建的pEAQ-HT-DEST1-GFP瞬时表达载体在烟草叶片中稳定工作。
图3 重组表达载体渗入后烟草叶片后GFP的表达情况Fig.3 GFP expression in tobacco leaves after infection with recombinant expression vector
研究发现，携带pEAQ-HT-DEST1-GFP载体的不同农杆菌菌株（GV3101、EHA105和LBA4404）渗入烟草后，GFP表达量均在处理后第4天达到最高，而且EHA105渗入植株的GFP表达量最高（图4A），说明EHA105是最适宜瞬时转化的菌株，而外源基因在渗入后第4天表达最高，然后表达下降。EHA105渗入本氏烟草的GFP表达效果（图4B）。比较不同浓度（OD600为0.4、0.6、0.8、1.0）的农杆菌EHA105菌液渗入效果，农杆菌渗透液浓度OD600=0.8时，GFP的表达效率最高（图4C）；
比较不同的真空渗透压力（40~100 kPa）发现，真空压力为80 kPa时，GFP的表达效率最高，达到80%（图4D）。
图4 农杆菌渗入的不同因素对GFP瞬时表达效率的影响Fig.4 Effects of different factors of agro-infiltration on transient expression efficiency of GFP
2.2 瞬时表达产物葫芦二烯醇的GC-MS鉴定
提取瞬时表达 pEAQ-HT-DEST1-HcOSC6的本氏烟草叶片，进行 GC-MS分析，采用 HPLC法测定其含量。在烟草叶片提取物出现新的分子离子峰 21.18 min（图5A），与葫芦二烯醇标准品的出峰时间一致，且分子峰碎片吻合（图5C，图5D），确定该峰为葫芦二烯醇。对照组中pEAQ-HT-DEST1-GFP渗透的烟草提取物中未发现葫芦二烯醇峰。由HPLC定量分析葫芦二烯醇（图5B），绘制标准品标准曲线（Y=1663.56953X-21.224813，r=0.98567；
Y为峰面积，X为葫芦二烯醇含量），测定葫芦二烯醇含量为2.832 mg/g（干重），当pEAQ-HT-DEST1-HcOSC6和pEAQHT-DEST1-tHMGR在烟草共渗透时，葫芦二烯醇含量达到9.48 mg/g（干重），提高了234.75%，实现了葫芦二烯醇在本氏烟草中的高效生产。
图5 烟草中葫芦二烯醇产物的GC-MS和HPLC分析Fig.5 GC-MS and HPLC analysis of cucurbitadienol tobacco products
2.3 11-羰基-20β-羟基-Cuol在本氏烟草中异源合成
由于农杆菌渗入法能够共表达多个目的基因，异源合成不同单体化合物，而无需逐步构建多个不同表达载体。大多数的 CYP450氧化酶在催化过程中都需要还原蛋白（CPR）的参与，利用本氏烟草本身的特性，一方面评估了农杆菌渗入本氏烟草内表达 CYP450氧化酶的潜力，另一方面在烟草中验证雪胆参与葫芦素生物合成的CYP同源基因HcCYP87D20。结果显示，在tHMGR、HcOSC6和HcCYP87D20共渗入烟草叶片中，在22.75 min提取出1个特异代谢产物（m/z457.3746 [M+H]+）（图6A），与 11-羰基-20β-羟基-Cuol标准品出峰时间一致，且质谱图一致（图6B）。空白对照组 pEAQ-HT-DEST1-GFP渗透的烟草中未发现11-羰基-20β-羟基-Cuol。
图6 Hc87D20在本氏烟草表达11-羰基-20β-羟基-Cuol产物的LC-qTOF-MS分析Fig.6 LC-qTOF-MS analysis of 11-carbonyl-20β-hydroxyl-Cuol products expressed by Hc87D20 in N.benthamiana
随着合成生物学领域的飞速发展，已阐明越来越多的天然药物的生物合成途经并实现高效异源合成，烟草作为重要的植物异源生产平台受到人们的广泛关注。目前，新冠肺炎COVID-19抗原已在烟草中实现了高效生产，用于制备新冠疫苗。农杆菌渗入本氏烟草为高效、快速表达疫苗抗原或单体药物提供了一个新的平台，然而，如何提高植物体内蛋白质和单体化合物产量是目前农杆菌渗入研究的重点和难点之一[21]。为了最大限度地提高基因表达水平，研究人员试图在多个水平上优化该过程，例如通过提高农杆菌转化率和改造特定载体包含增加转基因转录，翻译衍生的元件[22]。农杆菌的遗传背景极大地影响植物病原体T-DNA转移载体的能力。因此，本研究测试了3种常见的农杆菌携带pEAQ-HT-DEST1-GFP载体在本氏烟草中的GFP表达的能力，高活力菌株EHA105在4 d时GFP表达量最高，与其他2种菌株相比，EHA105可能更有效地编码农杆菌T-DNA转运。农杆菌渗入过程中的菌渗透液浓度会影响基因表达效率，过于稀释的菌渗透液可能会导致农杆菌细胞比例降低，从而降低外源基因表达效率，而浓度大的菌渗透液会导致农杆菌过度生长并损伤烟草叶片组织，影响本氏烟草细胞的转录或翻译能力，进而影响外源基因的表达效率[23-24]。此外，通过比较不同真空渗透压力发现，真空渗透压力过低，农杆菌不能有效地渗入，压力过高可能严重影响植物的生理状态。因此，本研究通过测试不同的农杆菌渗透条件，探索最佳的渗透条件以期为下一步的基因异源表达奠定基础。
目前，葫芦素B、E和F的生物合成尚未报道，本研究选择了特异性地含有葫芦素F的雪胆为研究对象，同时葫芦素F与其他葫芦素结构有许多相同修饰基团。本研究在本氏烟草验证雪胆的HcCYP87D20基因，以葫芦二烯醇为底物下连续催化C11位和C20位生成了11-羰基-20β-羟基-Cuol，但葫芦素F依然有多个位点的氧化修饰机理和基因未知，特别是C-22酮基和C-16α羟基位点等[8,25]。C-22酮基是所有葫芦素分子的另一共同结构特征，酮基一般为羟基氧化而来。目前报道的CYP90B家族催化C-22位羟化，例如参与油菜素内酯生物合成的DWF4基因（CYP90B1），能够催化菜油甾醇或 6-oxo-菜油甾醇的 C-22羟化[26-27]，在北美山藜芦（Veratrum californicum）甾体生物碱环巴胺的生物合成中，CYP90B27则编码胆固醇 22-羟化酶，催化胆固醇转化为22(R)-OH-胆固醇，CYP90G1能够转化22-OH-22-氨基-胆固醇为 22-酮基-22-氨基-胆固醇[28]。催化C-16α羟基方面，目前已报道有两类基因可以催化形成三萜类化合物的 C-16α羟化。一类属于CYP基因，分别是CYP716Y1和CYP716A141，编码C16α-羟化酶，能够催化香树脂骨架的C-16α羟化[25]；
一类是马铃薯（Solanum tuberosum）2-酮戊二酸依赖型加双氧酶（2-ODD，St16-DOX），编码类固醇 16α-羟化酶催化(22S)-22,26-二羟基胆固醇的 C-16α-羟化[26]。
在本研究中，将雪胆CBS基因（HcOSC6）、截短的燕麦tHMGR和HcCYP87D20共渗入烟草叶片中表达，虽然UPLC-ESI-qTOF-MS检测到了11-羰基-20β-羟基-Cuol，但未检测到 11-羰基-Cuol，这可能是CYP87D20氧化酶催化效率低，导致 11-羰基-20β-羟基-Cuol前提物质 11-羰基-Cuol不足，因此，下一步将利用酶工程手段提高CYP87D20活性，提高细胞色素P450氧化酶的催化效率，以实现葫芦素植物工厂的高效生产。
本研究将pEAQ-HT-DEST1-GFP与pAN580-GFP载体转化到农杆菌感受态细胞中渗透本氏烟草，确定在烟草细胞内定位结果一致。将雪胆CBS基因（HcOSC6）与截短的燕麦tHMGR共表达，不断优化烟草共表达体系，将烟草叶片中的葫芦二烯醇产量从2.832 mg/g（干重）提高到9.48 mg/g（干重）。同时，将雪胆的HcCYP87D20共渗入烟草叶片，获得了葫芦素生物合成的重要中间体11-羰基-20β-羟基-Cuol，实现了葫芦素中间体在本氏烟草中的异源生产，为葫芦素的生物合成奠定了坚实的基础。
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