何 龙,郭好雨,张超凡,杨紫薇,和娜娜,朱奎成
1)郑州大学第一附属医院麻醉与围术期医学部 郑州 450052 2)郑州大学医学科学院实验动物平台 郑州 450052
无毛(hairless,Hr)基因与毛发的生长关系密切。Hr基因缺陷小鼠表现为出生后2周左右被毛逐渐脱落，由此终生保持无毛状态[1-2]，无毛小鼠的能量代谢和体温均高于正常小鼠[3]，但是原因不明。棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)是哺乳动物体内的一种特殊脂肪组织，BAT通过激活解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)介导线粒体氧化呼吸的电子传递与ATP解偶联，降低氧化代谢的产能效率，使能量以热能形式散发，对维持机体能量代谢和体温恒定具有重要作用[4]。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)γ为配体激活核转录因子超家族成员，在BAT中高表达，参与脂肪前体细胞的分化和脂肪氧化过程[5]。PPARγ共激活因子-1α(PPARγ coactivator-1α,PGC1α)是PPARγ重要的协同作用分子，高表达于BAT、心肌、骨骼肌等高能量代谢组织，参与机体能量代谢调节[6]。无毛蛋白为一种核受体转录辅助抑制因子，具有较强的转录抑制功能[7]。无毛蛋白通过抑制PPARγ的表达参与脂肪组织的形成[8]。基于以上论述，我们提出Hr基因缺陷可能通过影响PPARγ-PGC1α-UCP1信号通路，引起BAT产热增加，导致Hr基因缺陷动物的较高能量代谢和较高体温状态，并通过动物实验对该假设进行了验证。
1.1 实验动物雄性Hr基因敲除(Hr-/-)和同窝野生型(Hr+/+)C57BL/6J小鼠各10只，由河南省实验动物中心提供，合格证号：SCXK(豫)2021-0099。饲养环境12 h明/暗交替，温度22～24 ℃，相对湿度40%～70%，动物自由取食、饮水。该实验已获得郑州大学生命科学伦理审查委员会批准。
1.2 小鼠活动量和能量代谢的监测出生后10周内，每周测定小鼠体重1次。第10周，采用TSE PhenoMasterV6.2.0(德国TSE Systems)代谢监测系统记录小鼠活动与全身代谢情况。将小鼠放置于TSE 系统代谢笼中24 h进行环境适应，而后开始记录参数，包括行走活动量与精细活动量，24 h进食量、饮水量、耗氧量和产热量。行走活动量与精细活动量通过代谢笼内的传感器测量，耗氧量、产热量、进食量和饮水量由TSE监控系统自动记录。
1.3 肛温及血清游离三碘甲状腺原氨酸(fT3)浓度测定第10周完成活动量与能量代谢测试后，使用小鼠肛温电子温度计(北京冀诺泰科技公司)测定肛温。七氟烷麻醉下断头处死小鼠，留取血液标本，室温静置2 h，3 000×g4 ℃离心10 min，取上清液-20 ℃保存。采用ELISA法(试剂编号XPEM1036，Xpress-Bio公司)检测fT3浓度。
1.4 BAT组织形态学观察小鼠处死后，取肩胛部BAT，40 g/L多聚甲醛固定24 h，乙醇脱水，二甲苯透化，石蜡包埋，5 μm 厚切片。常规HE染色，显微镜观察，采集图像分析(宁波舜宇RX50)。
1.5 BTA中PPARγ、PGC1α、UCP1蛋白表达的检测取出保存的BAT组织，剪碎放入组织研磨器中，加入预冷RIPA蛋白裂解液(美国Thermo ScientificTM)和蛋白酶抑制剂(德国Roche)，冰上研磨后静置10 min，3 000×g4 ℃离心10 min，取下层无油液体层，BCA法测定蛋白浓度。经SDS-PAGE电泳分离，湿转法将蛋白转移至0.45 μm孔径的PVDF膜(美国Merck Millipore)，50 g/L脱脂奶粉室温封闭1～2 h；
加入抗PPARγ(1∶2 000，上海Abcam)、抗PGC1α(1∶1 000，美国InvitrogenTM)、抗UCP1(1∶1 000，美国Biovision)、抗GAPDH(1∶3 000，上海Abcam)一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入HRP标记的二抗(1∶5 000)室温孵育1～2 h，TBST洗膜3次，超敏ECL发光液(美国Invitrogen)中浸泡10～20 s。用全自动化学发光成像系统(中国天能4800)采集图像，用Image-Pro Plus进行灰度分析，以目的蛋白与GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白表达量。
2.1 两组小鼠体重的比较见表1。Hr-/-小鼠和Hr+/+小鼠出生后体重均逐渐增加，但两组之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。
2.2 两组小鼠血清fT3浓度、肛温、进食量、饮水量的比较见表2。饲养第10周，两组小鼠血清fT3浓度差异无统计学意义(P>0.05)；
Hr-/-小鼠的肛温、进食量和饮水量均高于Hr+/+小鼠(P<0.05)。
表1 两种小鼠体重的比较 g
表2 两组小鼠血清fT3浓度、肛温、进食量、饮水量的比较
2.3 两组小鼠耗氧量、产热量及活动量的比较见表3。两组小鼠夜间行走活动量和精细活动量均大于白天(P<0.05)；
但两组间比较，活动量差异均无统计学意义(P>0.05)。Hr-/-小鼠耗氧量、产热量均高于Hr+/+小鼠(P<0.05)。
表3 两组小鼠耗氧量、产热量、活动量的比较
2.4 两组小鼠BTA形态见图1。BTA主要由多泡脂肪细胞构成，脂肪细胞内散在分布大小不均的脂滴空泡。与Hr+/+小鼠比较，Hr-/-小鼠BAT中多为小空泡，大空泡相对较少。
图1 Hr+/+(上)和Hr-/-(下) 小鼠BTA的HE染色观察结果
2.5 两组小鼠BTA中PPARγ、PGC1α、UCP1蛋白表达的比较见图2和表4。结果显示，PPARγ、PGC1α、UCP1蛋白在两组小鼠的BAT中均有表达，但是Hr-/-小鼠表达水平高于Hr+/+小鼠。
图2 两组小鼠BTA中PPARγ、PGC1α、UCP1蛋白的表达
表4 两组小鼠BTA中 PPARγ、PGC1α、UCP1蛋白表达的比较
无毛蛋白属于Jumonji蛋白家族。啮齿类动物和人类编码无毛蛋白的Hr基因突变可以导致显著的毛发生长障碍，表现为皮肤无毛并出现大量皱褶[9]。既往研究[3]发现，Hr基因突变的啮齿类动物，除了皮肤、毛发异常之外，机体还处于高能量代谢状态。
体温、进食量、饮水量是衡量动物能量获取的重要指标。耗氧量、产热量以及活动量是反映能量代谢的重要指标[10]。本研究结果显示，Hr-/-小鼠的体温、24 h进食量、24 h饮水量高于Hr+/+小鼠，同时耗氧量、产热量均高于Hr+/+小鼠，表明Hr-/-小鼠处于高能量代谢状态，此状态可能对维持无毛条件下的体温恒定具有重要作用。
甲状腺素对机体的正常发育和物质能量代谢具有重要的调节作用，血清fT3是甲状腺素的功能形式[11]。甲状腺素受体属于核受体，是一类受亲脂性配体调控的转录因子，最常见的功能是激活特异靶基因的表达[12]。酵母双杂交实验[13]结果显示无毛蛋白能直接与甲状腺素受体相互作用，在配体不存在时介导后者依赖性的转录抑制。但是本实验中，两组小鼠体重和血清fT3浓度差异无统计学意义，提示Hr基因缺陷并不影响动物甲状腺素的分泌和生长发育。两组小鼠活动量差异亦无统计学意义，提示耗氧量、产热量的增加并不是由活动量增加所致。上述结果说明Hr-/-小鼠的高能量代谢与甲状腺功能无关，可能存在其他机制介导了Hr-/-小鼠的高能量代谢。
哺乳动物的脂肪组织包括白色脂肪组织和BAT，白色脂肪组织具有储能功能，而BAT则介导将储存的能量以热能形式消耗掉。PGC1α主要在BAT、骨骼肌、心脏、肾脏、脑等能量要求高、线粒体丰富的组织中表达，作为辅因子与PPARγ结合，作用于UCP1的启动子，对BAT的产热起到关键作用[14]。本研究中，Hr-/-小鼠BAT中类似白色脂肪组织中的大脂滴减少，同时BAT中PPARγ、PGC1α和UCP1蛋白表达高于Hr+/+小鼠，提示Hr-/-小鼠BAT的产热功能可能增强。
综上所述，Hr基因缺陷可能通过激活PPARγ- PGC1α-UCP1信号通路，增加BAT能量代谢和产热功能，介导了Hr基因缺陷小鼠的高能量代谢和高体温状态。
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