温 金 李 宁 李梓汇 马智颖 毛海婷
山东大学第二医院检验医学中心，山东 济南 250033
细胞焦亡（pyroptosis）是一种炎性程序性细胞死亡模式，依赖于炎性蛋白酶的活性，这些蛋白酶属于含有半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶（cysteine-dependent aspartate-specific proteases，caspase）家族，在这一过程中，Gasdermin（GSDMD）家族是细胞焦亡的关键执行蛋白［1］。细胞焦亡广泛参与肿瘤、缺血再灌注损伤、感染性疾病、中枢神经系统疾病等的发生发展［2］。研究发现，滋养细胞焦亡也是胎盘中的重要促炎途径，滋养细胞损伤后破裂，释放出大量炎症因子，诱导免疫细胞聚集，过度激活炎性反应，导致血管内皮损伤和局部组织无菌性炎症反应，进而导致复发性流产、子痫前期、妊娠期糖尿病、早产等一系列不良妊娠结局［3］。本文就细胞焦亡在不良妊娠结局中的研究进展进行综述。
细胞焦亡这个术语来源于希腊词根“pyro”，被用来描述促炎程序性细胞死亡方式［4］。细胞焦亡也存在DNA 损伤、核固缩和caspase 依赖性等与细胞凋亡相似的特征，但又有独特的形态学特征，表现在以下几个方面：首先，焦亡是一种非常特殊的DNA 损伤形式，细胞发生焦亡时，尽管出现了染色质凝结和DNA 断裂，但细胞核仍然保持完整。而在凋亡细胞中，DNA 的损伤依赖于caspase-3 激 活 的 DNA 酶（caspase-activated Dnase，CAD）和 其特异性分子伴 侣（inhibitor caspase-3 activated Dnase，ICAD）结合的二聚体，其中ICAD 被裂解，同时释放并激活CAD，降解DNA，诱导细胞凋亡，而在焦亡细胞中，即使caspase-1 可以切割CAD，DNA 的损伤也不需要CAD 完成［5］。其次，细胞发生凋亡时其胞膜是完整的，而焦亡细胞膜上会形成小孔，破坏细胞膜的完整性。水通过孔隙流入，导致细胞肿胀和渗透破裂，释放出炎症介质，引起强烈的炎症反应［6］。第三，细胞凋亡和细胞焦亡都依赖caspase 的激活。早期研究普遍认为，caspase-3/6/7/8 激活只发生在凋亡细胞中，而只有激活炎性的caspase-1 和caspase-11 才能诱导焦亡。然而，近期研究发现，caspase-3 也参与了细胞焦亡［7］。最后，细胞焦亡的发生与多聚腺苷酸（adenosine diphosphate，ADP）聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）无关［8］，这一点与凋亡不同。
2.1 炎症小体
炎症小体（inflammasomes）是含有模式识别受体（pattern-recognition receptor，PRR）的多分子复合体，通过刺激炎症反应激活PRR 而触发细胞焦亡。PRR 可以识别病原体相关分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）和细胞损伤过程中释放的危险相关分子模式（damaged-associated molecular patterns，DAMPs）［9］，PRRs 在识别DAMPs和PAMPs 后诱导凋亡相关颗粒样蛋白（apoptosisassociated speck-like protein containing CARD，ASC）形成一个巨大的分子组装，连接Nod 样受体［nucleotide oligomerization domain （NOD） -like receptors，NLRs］和caspase-1［10］。在经典的炎症小体途径中，该复合物激活caspase-1，在非经典的炎症小体途径中，该复合物通过激活小鼠caspase-11和人的caspase-4，5而触发细胞焦亡［11］。
2.2 GSDMD家族
GSDMD 是活化的caspase-1/4/5/11 的底物，可被裂解为含有N端结构域（GSDMD-NT）和C端结构域（GSDMD-CT）的两部分片段［12］。GSDMD-NT连接细胞膜上的磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰丝氨酸，引发寡聚，导致细胞膜上孔隙形成，成熟的白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18 以及其他胞内容物通过孔隙释放到细胞外。这一过程有别于细胞凋亡的炎症过程。此外，GSDMD-CT 端具有可溶性，被认为会返回到GSDMD-NT端，抑制其激活［13］。早期研究表明，活化的caspase-1/4/5/11 可通过裂解GSDMD引起细胞焦亡，但近年来研究发现，caspase-3也可影响并激活GSDME，从而引发细胞焦亡［12-13］。
3.1 经典细胞焦亡通路
经典的炎症小体包括NLRP1，3、NLRC4 和AIM2，它们都具有N 端caspase 募集域（N-terminal caspase recruitment，CARD）或pyrin 结构域（pyrin domain，PYD），当PRRs 与PAMPs 和DAMPs 接触后可以激活caspase-1［14］。这些炎性小体可以募集ASC，NLR 或AIM2信号域（PYD 或CARD）通过同型相互作用与ASC 连接，形成ASC 焦点，招募pro caspase-1，导致caspase-1 激活。在这一过程中，pro caspase-1 进行自裂解，导致caspase-1 p10/p20 四聚体形成和活化，caspase-1 活化后参与IL-18 原体和IL-1β原体的成熟，并切割IL-18原体和IL-1β原体，后者被释放到细胞外并触发一系列炎症反应［15-16］。同时，caspase-1 活化也可形成1.1 ～ 2.4 nm 的质膜孔隙，水从孔隙流入导致细胞肿胀、裂解，伴有促炎介质HMGB1、IL-1β、IL-18 的分泌而发生焦亡［15，17］。然而，caspase-1如何引起焦亡的具体机制尚未完全明确。
综上所述，GSDMD 是caspase-1/4/5/11 的直接底物，可被炎性caspase 特异性切割，在炎性caspase的下游发挥重要作用。GSDMD 在质膜上形成孔隙，导致膜缺陷和胞质蛋白释放，引起一系列炎症反应。
3.2 非经典细胞焦亡通路
人类非典型炎症小体途径由caspase-11 和caspase-4/5 触发。caspase-11 识别并结合到来源于革兰氏阴性菌或宿主来源的氧化磷脂的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）上，由此激活caspase-11，活化的caspase-11 既能直接诱导细胞焦亡，又能通过裂解GSDMD 激活caspase-1。另外，在caspase-3介导的细胞焦亡通路中，成熟的caspase-3可以切割人gasdermin E （GSDME）蛋白的连接体，使GSDME裂解为C 端片段（GSDME-CT）和N 端片段（GSDMENT），GSDME-NT 参与胞膜孔隙的形成，导致细胞焦亡［18］。
4.1 细胞焦亡与复发性流产
复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指女性连续发生2 次或2 次以上的自然流产，其发病原因包括遗传学、感染、免疫等多种因素［19］。研究发现，在RSA患者的母胎界面处高迁移率族蛋白B（high mobility group box 1，HMGB1）、GSDMD、NLRP-3以及caspase-1分子高表达；
在易流产小鼠模型中，小鼠蜕膜组织中的巨噬细胞高分泌HMGB1，HMGB1 抑制剂阿司匹林可通过HMGB1-TLRs/RAGE-NF-κB 通路下调巨噬细胞来源的HMGB1的表达，给予流产小鼠阿司匹林治疗后，小鼠血清中HMGB1 水平显著下降，胚胎流产率明显降低［20］。Park 等［21］发现，山莨菪卷须热水提取物（tendrils of cucurbita moschata duchesne， TCMD）可以减弱炎症小体激活物［如LPS、ATP、黑素和尿酸钠（monosodium urate，MSU）］引起的小鼠巨噬细胞和人滋养细胞NLRP3 炎性小体激活，限制ASC 寡聚，抑制caspase-1的活化以及IL-1β的成熟和释放。尽管目前尚未见报道NLRP1炎症小体与RSA有关，但其已被证实参与先兆流产的发生［22］。以上研究结果提示，RSA 患者子宫内膜中普遍存在caspase-1、炎性小体等焦亡相关炎性标志物的激活以及炎症介质释放诱导无菌性炎症和组织损伤的状况，而通过减弱或抑制滋养细胞焦亡可以有效扭转这种炎症状态，阻止RSA发生。
4.2 细胞焦亡与子痫前期
子痫前期（preeclampsia，PE）是一种妊娠特异性高血压综合征，以高血压、蛋白尿为主要临床表现，是造成母亲和胎儿死亡的重要原因［23］。PE时由于滋养细胞侵袭不足而导致子宫螺旋动脉重塑障碍，胎盘血管因灌注不足诱导了氧化应激反应，释放多种胎盘因子，引起ROS 积聚，从而激活NLRP3炎性小体并促进细胞焦亡的发生［24］。近期研究发现，特异性microRNAs（miRNAs）在PE 相关的生物通路中发挥关键作用。在滋养细胞HTR8-S/Vneo中过表达miR-125a-3p，通过靶向调控胎盘生长因子，可以抑制滋养细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡和炎症因子NLRP3、caspase1、IL-1β和ROS释放［25］。除此之外，Liu 等［26］证实，脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）可以抑制caspase-1的活化、滋养细胞的焦亡以及血管紧张素Ⅱ1 型受体（angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R）的暴露，而PE患者胎盘缺乏LXA4，导致患者胎盘中caspase-1 和炎症因子IL-1β、IL-18的水平明显升高。另有研究显示，二甲双胍可以抑制PE 滋养细胞中TLR4/NF-κB 信号通路，抑制NLRP3 炎症小体释放，从而抑制滋养细胞焦亡［27］。因此，滋养细胞焦亡是诱发子痫前期的关键事件，阻断其发生的途径可能是PE潜在的治疗策略。为进一步探究细胞焦亡在PE 中的机制，Quan 等［28］使用缺氧/复氧（H/R）模型刺激人和大鼠滋养细胞并首次发现，在H/R条件下，可上调趋化素的表达，并通过趋化素激活CMKLR1/AMPK/TXNIP/NLRP3 炎症小体通路而加重H/R诱导的滋养层细胞的焦亡。
总之，PE 时子宫螺旋动脉重塑异常，诱发了强烈的氧化应激反应，释放大量炎性介质，这不仅导致滋养细胞功能受损、胚胎浅着床、血管形成障碍，而且释放炎症因子后诱发免疫细胞聚集，使母体血管内皮广泛受损，在这一过程中，滋养细胞的焦亡发挥了重要作用。目前关于PE 与焦亡的研究中，NLRP3炎性小体复合物途径的研究比较多，对焦亡其他途径的研究较少，后续仍需进一步探索。
4.3 细胞焦亡与妊娠期糖尿病
妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是孕妇的一种代谢紊乱疾病，其特征是在妊娠中期或晚期出现葡萄糖不耐受与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）［29］。Yu 等［30］在GDM 患者的脂肪组织中观察到炎症小体、caspase-1 和成熟IL-1β分泌升高，干扰胰岛素信号通路，导致GDM产生IR。有研究指出，胎盘中H2S 合成酶缺乏可能引起NLRP3炎症小体的过度激活，进而导致IL-1β和IL-18 升高，从而引发母体IR，导致糖代谢异常［31］。另外，近期的研究也发现，活性氧（reactive oxygen species，ROS）有助于促炎细胞因子和NLRP3 炎性小体的激活，并且诱发细胞损伤。Negi等［32］检测到别嘌醇可以抑制葡萄糖诱导的滋养细胞caspase-1的激活，减少IL-1β和ROS分泌，降低了额外的促炎和抗血管生成反应。在体内实验中，采用C57BL/KsJ-db/+ （db/+）孕鼠作为GDM小鼠模型，每日给予NLRP3 抑制剂曲尼司特治疗2 周后，可以显著降低GDM 小鼠NLRP3 和促炎细胞因子的表达，改善母体高血糖、葡萄糖不耐受和IR 等症状［33］。研究发现，类黄酮物质—前花青素（procyanidins，PA）形成的结合产物可以被肠上皮吸收后，在肠道菌群产生的一系列酶的作用下，经过分离转化后具有抗糖尿病的活性［34］。因此，在采用高脂高蔗糖饲料喂养构建的GDM小鼠模型中，在孕前4周至分娩期间进行PA 干预治疗，PA 可通过NF-κB/NLRP3 途径显著降低妊娠母体体质量、空腹血糖，提高胰岛素敏感性。有趣的是，给GDM 小鼠注射广谱抗生素，建立肠道菌群缺陷的（intestinal flora deficient，IFD）小鼠模型，在IFD 小鼠中PA 改善IR 的作用明显减弱［35］。以上结果提示，在GDM 发病过程中，高糖可诱导细胞焦亡并释放IL-1β、IL-18等炎性介质，导致局部以及全身炎症并引发胰岛素抵抗，因此，有效抑制母胎细胞焦亡及其导致的炎症小体和炎性因子的释放有望成为GDM治疗的新靶点。
4.4 细胞焦亡与早产
早产是指孕龄小于37周时发生分娩，是新生儿发病和死亡的重要原因［36］。引起早产的原因有多种，现有的证据表明感染导致的炎症反应是引起早产的主要原因之一。Jaiswal 等［37］利用TLR3 激动剂Poly（I∶C）联合TLR2 配体肽聚糖（peptidoglycan，PGN）分别模拟革兰阳性菌及病毒感染，诱导构建早产小鼠模型，发现早产小鼠中NLRP3 表达和caspase-1 活化增加，诱发子宫焦亡和炎症过程，从而诱导早产。另一项研究发现，纯化的B 族链球菌（group B streptococci，GBS）产生的色素/脂质毒素可诱导细胞膜通透性改变和细胞内钾外排，导致红细胞渗透裂解，并通过激活巨噬细胞NLRP3炎症小体和caspase-1 而诱导焦亡［38］。高溶血/色素的GBS 菌株以NLRP3 炎症小体依赖或独立的方式增加了早产和宫内胎儿死亡的发生率［39］。综上所述，感染或炎症可激活焦亡的发生，导致促炎因子表达增加，诱发子宫平滑肌收缩，增加胎儿早产风险。
近年来，对于流产、PE、GDM、早产等不良妊娠疾病的研究越来越多，但对于其病因及发病机制目前尚未完全阐明。滋养层细胞焦亡及相关焦亡信号通路与不良妊娠结局的发生密切相关。以滋养细胞焦亡相关的NLRP3、caspase-1 等炎症因子作为治疗靶点，为早期预防与治疗不良妊娠提供了新思路。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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