詹江辉，杨雪，狄文玉，鲁广建
(1.新乡市第二人民医院 检验科，河南 新乡 453002；
2.新乡医学院第一附属医院 a.输血科;b.病理科;c.检验科，河南 新乡 453100)
肾细胞癌中最常见的病理类型是肾透明细胞癌，目前肾透明细胞癌主要通过手术切除来达到治疗的目的，但是大约30%的患者在随访中发现手术后发生复发及转移，因此肾透明细胞癌较其他类型肾癌预后差[1]。有研究显示miR-221在不同的恶性肿瘤组织中表达升高。有研究者筛选出由miR-181b-5p、miR-183-5p、miR-199-5p和miR-221-3p组成的多种miRNA组合在预测膀胱癌发生方面更好、更可靠，可以代表膀胱癌诊断的稳定生物标志物[2]。另外，有研究发现miR-221/222的异常表达可以改变前列腺细胞对雄激素的反应，从而潜在参与向去势抵抗前列腺癌转变，上调miR-221/222的表达可以促进肿瘤的转移[3]。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程中上皮细胞失去上皮特征和完整性，获得间充质特征，运动能力增加。E-cadherin是黏附连接的关键成分，E-cadherin表达缺失导致接触抑制缺失，并与细胞活力增加和癌症晚期相关[4]。因此，本研究通过检测肾透明细胞癌中miR-221的表达及EMT相关分子E-cadherin的表达，并分析其相关性，探讨miR-221在肾透明细胞癌高表达的临床意义，为肾细胞癌的生存及预后提供潜在的生物标志物。
1.1 研究对象选取2015年1月至2016年12月在新乡医学院第一附属医院接受根治性肾切除术符合纳入排除标准的38例肾透明细胞癌患者作为研究对象，并收集癌组织标本作为实验组，癌旁正常组织标本为对照组。患者确诊肾透明细胞癌后进行随访，随访时间为5 a，若在此期间患者死亡则停止随访。纳入标准：(1)接受手术治疗且术后经过病理诊断为原发性肾透明细胞癌；
(2)手术前未接受放疗、化疗、靶向治疗等抗癌治疗；
(3)临床资料完整容易收集；
(4)出院后随访资料容易获得且未失访。排除标准：(1)术中未能完整切除肿瘤组织；
(2)合并有其他系统恶性肿瘤；
(3)合并肾炎；
(4)先天性肾畸形或发育不良。
1.2 主要试剂与仪器TRIzol购自美国Invitrogen公司，M-MLV Reverse Transcriptase购自美国Promega公司，Sybr green Ⅰ mix购自日本Takara公司，ABI PRISM 7000荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems公司，鼠抗人E-cadherin抗体及免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，BX53显微镜购自日本Olympus公司。
1.3 实验方法
1.3.1总RNA的提取 取出液氮中保存的癌组织及癌旁组织，放于研钵中，其间不断加入液氮待研磨成粉末之后将其装入EP管中。加入TRIzol裂解试剂 1 mL，用吸管反复吹吸以充分裂解。加入氯仿200 μL，剧烈震荡1 min充分萃取。4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min，上清液中即为提取的RNA。吸取上清液至另一新的EP管中，加入等量的异丙醇。4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，加入体积分数为75%乙醇后混合均匀，4 ℃ 12 000 r·min-1离心5 min。弃去上清液，放置冰上让乙醇充分挥发。加入适量的DEPC水，使RNA溶解。使用分光光度计测定提取出来的RNA的浓度，OD260/OD280在1.7～2.1时，说明RNA纯度较高。
1.3.2qRT-PCR检测肾透明细胞癌及癌旁组织中miR-221的表达 根据M-MLV Reverse Transcriptase试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA。按照Sybr green Ⅰ mix试剂盒说明在20 μL反应体积中进行实时荧光定量PCR。反应条件：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 S，30个循环；
72 ℃再延伸5 min。每组做3个复孔。使用U6作为内参，通过2-ΔΔCt方法计算miR-221的相对表达量。
1.3.3免疫组织化学染色 将收集好的癌组织标本及相应的癌旁组织标本放入组织固定液里面固定4 h。将组织块放入梯度酒精中脱水。放入二甲苯溶液中透明处理，然后浸蜡，包埋，切片，脱蜡，水化。放于枸橼酸钠溶液中，然后将其放入微波炉中修复抗原表位。切片上滴加H2O2封闭内源性过氧化物酶。在切片上滴加山羊血清封闭液封闭非特异性位点。组织切片上滴加鼠抗人E-cadherin一抗，放置于4 ℃的冰箱里过夜。组织切片上滴加试剂盒中的二抗。滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液。组织切片上滴加DAB显色液。滴加苏木精染色液进行复染5 min。再进行脱水，透明，封固。在高倍显微镜下观察染色情况并拍照。
1.4 免疫组织化学染色判断标准每张切片在200倍显微镜视野下随机选取5个不同的视野，由两位高年资的病理医生分别进行独立阅片。根据200倍显微视野下的染色程度和阳性染色细胞百分比进行综合评分，其中阳性细胞百分比评分规则为：≤5%记为0分，6%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，76%～100%记为4分。染色程度评分规则为：未着色记为0分，着浅黄色记为1分，着棕黄色记为2分，着棕褐色记为3分。计算染色程度和阳性细胞百分比的乘积。乘积结果为0～4分判断为低表达，低表达结果判断为阴性；
6～12分判断为高表达，高表达结果判断为阳性[5]。
2.1 miR-221在肾透明细胞癌组织与癌旁组织中的表达及与临床病理参数的关系miR-221在实验组中相对表达量为4.911±1.064，在对照组中相对表达量为1.163±0.238，在实验组中相对表达量高于对照组，两组间比较差异有统计学意义(P<0.001)(见图1)。在癌组织标本中，miR-221的相对表达量在Fuhrman不同分级、有无淋巴结转移方面差异有统计学意义(P<0.05)，不同年龄、性别、肿瘤大小、肾静脉内有无癌栓方面差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。
图1 qRT-PCR检测肾透明细胞癌患者实验组及对照组中miR-221表达
表1 miR-221表达与肾透明细胞癌患者临床病理参数的关系
2.2 肾透明细胞癌患者E-cadherin的表达及与临床病理参数的关系免疫组织化学染色结果显示E-cadherin主要表达于细胞膜上(见图2、3)。在实验组中E-cadherin表达阳性率为26.32%(10/38)，对照组中E-cadherin表达阳性率81.58%(31/38)，两组表达差异有统计学意义(χ2=23.356，P<0.001)。E-cadherin的表达在不同年龄、性别、肿瘤大小、有无淋巴结转移、癌栓形成方面无统计学意义(P>0.05)，在Fuhrman不同分级方面差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。
A为肾透明细胞癌组织；
B为癌旁组织。图2 肾透明细胞癌与癌旁组织HE染色(200×)
表2 E-cadherin与肾透明细胞癌病理参数的关系[n(%)]
2.3 肾透明细胞癌患者miR-221的表达与E-cadherin的相关性对肾透明细胞癌患者癌组织中miR-221与E-cadherin的表达进行Spearman相关性分析，相关系数r为-0.569(P<0.001)，表明miR-221与E-cadherin的表达呈负相关(见图4)。
图4 肾透明细胞癌患者癌组织中miR-221的表达与E-cadherin表达的Spearman相关性分析
2.4 肾透明细胞癌患者癌组织中miR-221表达与患者生存预后的关系在肾透明细胞癌患者癌组织中miR-221表达平均数为4.911，以4.911为界限，将肾透明细胞癌患者分为miR-221高表达组(>4.911)17例和miR-221低表达组(<4.911)21例，其中失访病例已排除出组。38例肾透明细胞癌患者经过5 a随访，总生存26例，死亡12例。Kaplan-Meier法生存曲线结果显示miR-221高表达组5 a生存率为52.94%(9/17)，miR-221低表达组5 a生存率为80.95%(17/21)，miR-221高表达组与miR-221低表达组生存曲线比较log-rank检验结果差异有统计学意义(χ2=4.329，P=0.037)(见图5)。
图5 肾透明细胞癌患者癌组织中miR-221高表达组和低表达组的生存曲线
肾细胞癌是比较常见的泌尿系统恶性肿瘤，其中肾透明细胞癌是最常见的肾细胞癌类型，占肾恶性肿瘤的90%，其他亚型包括乳头状肾细胞癌占6%～15% ，嫌色肾细胞癌占2%～5%[6]。早期发现对患者预后非常重要，被诊断为器官局限性疾病的患者5 a生存率约为90%，而远处转移患者的预后仍然很差，5 a生存率不到10%[7-8]。肿瘤复发主要是由于肾细胞癌对化疗和放疗的抵抗，5%～10%的肾透明细胞癌病例延伸到肾静脉或下腔静脉[9]。舒尼替尼通常用作肾细胞癌的一线治疗，尽管舒尼替尼对10%～20%的晚期肾细胞癌患者本身治疗无效[10]。因此，迫切需要增加对肾细胞癌进展和转移的分子机制的了解，同时发现分子标志物用于肾癌的预后评估。
miRNA是一类高度保守、半衰期长的非编码小分子RNA。成熟的miRNA以20～24个核苷酸的miRNA双链体形式存在，包括miRNA引导链及其互补的过客链[11]。研究显示miR-221在不同的癌症类型中表达升高，其具有类似癌基因的功能。在膀胱癌中，有研究发现miR-221的下调通过增加TP53INP1诱导自噬，并通过抑制ERK的激活来抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭，并且miR-221与膀胱癌患者的不良生存率相关[12]。在肝癌中，研究发现miR-221的表达显著高于邻近正常组织，且miR-221表达与肝癌患者的肿瘤TNM分期有相关性，miR-221表达降低可以延长肝癌患者的生存时间[13]。在胃癌中，与癌旁组织相比，肿瘤组织中miR-221表达明显升高，miR-221表达较高的患者预后明显较差，miR-221可以调控胃癌细胞的增殖和凋亡[14]。有研究者使用癌症基因组图谱数据的生存分析表明，miR-221的高表达与结直肠癌患者的低生存率相关，表明miR-221可能通过抑制自噬和靶向TP53INP1促进结直肠癌的细胞增殖[15]。有研究显示miR-221的靶基因包括p27 Kip1、p57 Kip1、PTEN、c-kit等，除此之外，miR-221在平滑肌细胞增生和人类老龄化进程中也起着重要的作用[16]。本研究检测肾透明细胞癌中miR-221的表达，研究结果显示在癌组织中miR-221表达量高于对照癌旁组织，临床病理参数分析结果表明miR-221的表达与年龄、性别、肿瘤大小、静脉内癌栓无关，而与淋巴结转移及Fuhrman分级有关。
EMT是一种最初在发育早期观察到的过程，在这个过程中可将极性固定的上皮细胞转化为间充质细胞，运动能力增加。在EMT的过程中，具有上皮特征的E-cadherin表达降低，具有间充质特征的N-cadherin、波形蛋白等表达量增加[17]。E-cadherin表达的丧失与癌症进展和转移有关，多项研究表明，E-cadherin在癌细胞中低表达。有研究者使用免疫组化检测170例食管鳞状细胞癌组织和相应的正常食管黏膜组织中E-cadherin的表达情况，食管鳞状细胞癌组E-cadherin表达阳性率明显低于对照组，E-cadherin表达的阳性率与分化等级、肿瘤分级、淋巴结转移阶段显著相关[18]。对78例经过保乳手术治疗的乳腺癌患者进行研究，将有腋窝淋巴结转移患者设为实验组，发现实验组E-cadherin阳性表达率低于对照组，该实验证实了乳腺癌患者保乳术后腋窝淋巴结转移与E-cadherin表达降低有一定的相关性[19]。本实验使用免疫组化检测E-cadherin在肾透明细胞癌中的表达情况，结果显示E-cadherin在癌组织中阳性率低于癌旁组织。E-cadherin的表达与miR-221的表达呈负相关。Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验结果显示miR-221高表达组与miR-221低表达组的生存曲线差异具有统计学意义。
综上所述，miR-221在肾细胞癌中表达升高且与临床Fuhrman分级及淋巴结转移有关，miR-221与EMT相关分子E-cadherin的表达有相关性。本研究表明miR-221在肾透明细胞癌EMT进展过程中发挥一定的作用，是肾透明细胞癌患者生存及预后评估的潜在生物标志物。
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