孙天赐, 杨 怀, 闫 旭, 方蔚伟, 张培松, 何 涛
(1.合肥工业大学 化学与化工学院,安徽 合肥 230009; 2.武警安徽省总队医院 普外三科,安徽 合肥 230061)
磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)无辐射、安全性高、软组织分辨能力较强,在临床影像医学肿瘤检测上应用广泛[1]。MRI通常需要使用造影剂(contrast agent)进行高分辨的影像学诊断[2]。临床上一般用低分子量的钆(Gd)类鳌合物造影剂来提升磁共振信号,如Magnevist、Omniscan等,但这些造影剂具有体内循环时间短、弛豫率低、用药量大等缺点[3-5]。近年来,为了克服现有造影剂的缺点,纳米技术被广泛应用于MRI造影剂的研究中,相关研究表明尺寸小于20 nm的纳米造影剂具有较低的细胞摄取水平以及更长的体内滞留时间[6-7]。两亲性聚合物纳米颗粒是良好的药物传递载体,将钆融入聚合物纳米中制备的纳米造影剂有良好的弛豫性能[8]。两亲性聚合物纳米颗粒一般基于树枝状聚合物、星状聚合物等结构,或者是由两亲性共聚物自组装得到[9]。但是树枝状聚合物、星状聚合物纳米合成步骤繁琐,提纯困难[10];由两亲性共聚物自组装得到的聚合物纳米结构不稳定[11]。因此,制备合成过程简单、无需自组装的两亲性聚合物纳米载体具有重要的科研和利用价值。
本文直接合成不需要自组装的两亲性支化共聚物纳米颗粒,并用于合成纳米造影剂。采用可逆加成-断裂链转移聚合(reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization,RAFT)方法,以疏水性单体甲基丙烯酸正丁酯(n-BMA)与交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)共聚物链段作为疏水性内核,亲水性单体寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA)与含1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸三叔丁酯(DO3A)结构的单体共聚物链段作为亲水性支链形成两亲性支化聚合物纳米颗粒(P(DO3A)),与氯化钆(Ⅲ)六水合物(GdCl3·6H2O)进行螯合反应后合成了一种新型的MRI纳米造影剂P(DO3A-Gd3+);研究了P(DO3A-Gd3+)生物安全性以及MRI造影性能,结果表明:P(DO3A-Gd3+)具有良好的生物安全性以及显著的MRI造影增强效果;P(DO3A-Gd3+)纳米颗粒由单个支化聚合物纳米颗粒P(DO3A)螯合Gd3+构成,无需自组装,合成方法简单,可大量制备,有临床转化的潜力。
1.1 主要试剂与仪器
4-氰基-4-(苯基碳硫硫基硫代)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(CTA-NHS)购于Aldrich;寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA,Mw为300)、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、溴乙酸(BA)、甲基丙烯酸正丁酯(n-BMA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三乙酸叔丁醇乙酯(TBTT)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，均购于Aladdin;三氟乙酸(TFA)、氯化钆(Ⅲ)六水合物(GdCl3·6H2O)、二氯甲烷(DCM)、乙腈、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，均购于国药集团。
采用安捷伦VNMR S600型核磁共振仪进行核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance,1H NMR)测试;采用马尔文MS-2000型激光粒度分析仪进行动态光散射(dynamic light scaltering,DLS)测试;采用日本JEM-2100F型场发射透射电子显微镜(field emission transmission electron microscope,FETEM)分析样品形貌结构。
1.2 实验过程
1.2.1 聚合物纳米造影剂的合成
聚合物纳米造影剂的合成过程如图1所示。
图1 聚合物纳米造影剂的合成过程
将HEMA(1 mmol/L)与BA(1.5 mmol/L)溶解在20 mL DCM中,反应24 h,通过纯化得到产物HEMA-BA。将HEMA-BA(1 mmol/L)与TBTT(1 mmol/L)溶解在20 mL 乙腈中,反应24 h,通过纯化得到产物HEMA-TBTT。
链转移剂CTA-NHS(0.1 mmol/L),单体OEGMA(1 mmol/L)、HEMA-TBTT(0.5 mmol/L),引发剂AIBN(0.01 mmol/L)在反应管中溶解于3 mL DMF,随后在无氧条件下70 ℃反应12 h。反应结束后,减压除去溶剂,粗产物在甲醇中沉降3次,干燥得到共聚物P1(POEGMA-HEMA-TBTT)。
将P1(0.8 g,1 mmol/L),单体n-BMA(10 mmol/L),引发剂AIBN(0.01 mmol/L),交联剂EDGMA(0.15 mmol/L)溶解于4 mL DMF中,液氮冷冻脱气,70 ℃下反应10 h。反应结束后,减压除去溶剂,粗产物在甲醇中沉降3次,干燥得到支化共聚物纳米颗粒P2(PEGDMA-n-BMA-OEGMA-HEMA-TBTT)。
上述支化聚合物P2(2.00 g)与TFA(10 mL)溶解在20 mL DCM中,0 ℃下反应4 h,切断HEMA-TBTT链段中的叔丁基。反应结束后,粗产物去除溶剂,用5 mL THF复溶,随后在冰的正己烷中沉降,真空干燥后得到产物P3(PEGDMA-n-BMA-OEGMA-HEMA-DO3A)，简称P(DO3A)。
将P3(1 g)溶解在15 mL 异丙醇中,将GdCl3·6H2O(1.86 g,5 mmol)溶解在50 mL 乙酸铵中后与上述溶液混合,55 ℃下反应24 h。反应结束后,混合溶液在水中透析48 h,干燥后用THF复溶,随后在冰的正己烷中沉降,真空干燥后得到纳米造影剂P4(P(DO3A-Gd3+))。
1.2.2 细胞安全性测试
细胞安全性的测试采用标准的3-(4,5二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法[12]。将小鼠乳腺癌细胞(4T1)以5×104个/孔接种于含有细胞培养基的96孔板中,然后加入不同浓度Gd3+的P(DO3A-Gd3+),在37 ℃、5% CO2环境下共培养24 h。采用PBS洗涤细胞3次,再在每个孔板中加入50 μL MTT(1 mg/mL),于37 ℃继续培养4 h。接着去除上清液,加入100 μL二甲亚砜后摇匀,用分光光度酶标仪(Elx800,BioTek,USA)测定570 nm处的吸光度,相对细胞活性计算公式为:
相对细胞活性=(Atreated/Acontrol)×100%,
其中:Atreated为P(DO3A-Gd3+)共培养后的吸光度;Acontrol为培养液的吸光度值。
1.2.3 生物安全性测试
将10只新西兰小鼠(雄性,24 g)分为2组:一组通过尾静脉注射P(DO3A-Gd3+)作为实验组;另一组不做任何处理作为对照组。将2组小鼠在相同的环境下培育14 d,通过观察2组小鼠的生理状况来评估P(DO3A-Gd3+)的生物安全性。
1.2.4 体外弛豫率的测定
将P(DO3A-Gd3+)溶液以及Magnevist注射液各稀释至含Gd3+浓度为0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.800 mmol/L的水溶液,移至离心管中并置于临床Siemens Magnetom Trio 3.0T MR成像仪中扫描,测得不同浓度的纵向弛豫时间T1,仪器参数为:回波时间TE为7 ms;重复时间TR为31、300、700、1 400、2 500、3 500、5 500、7 500 ms。弛豫率r1由纵向弛豫时间T1的倒数对Gd3+浓度进行线性拟合得到。
1.2.5 体内MRI测试
用10%的水合氯醛麻醉25 g的小鼠后,尾静脉注射P(DO3A-Gd3+)水溶液(Gd约0.05 mmol/kg),置于临床Siemens Magnetom Trio 3.0T MR成像仪中扫描。分别收集0、60、120 min时的T1加权图像。
2.1 P(DO3A)的合成
聚合物纳米P(DO3A)的1HNMR谱图如图2所示。
从图2可以看出,P2链段中各单体的主要氢质子的化学位移有δ=1.38处表示HEMA-TBTT链段上叔丁基的质子峰;δ=0.93处表示聚合物主链上甲基的质子峰;δ=1.80处表示聚合物主链上亚甲基的质子峰;δ=3.64、3.53处表示POEGMA链段上亚甲基的质子峰;δ=3.64处归属于POEGMA链段上末端甲基的质子峰;δ=3.92,1.59,1.31处表示n-BMA链段上亚甲基的质子峰;δ=0.85处为n-BMA链段末端甲基的质子峰,表明聚合物纳米P(DO3A)的成功合成。
图2 聚合物纳米P(DO3A)的1H NMR谱图
2.2 P(DO3A-Gd3+)的形貌和尺寸分析
对鳌合钆后的P(DO3A-Gd3+)纳米颗粒水溶液进行形貌和尺寸分析,如图3所示。
图3 P(DO3A-Gd3+)纳米颗粒水溶液形貌和尺寸
从图3a可以看出,纳米颗粒的尺寸在100 nm左右,呈单分散状态且形貌比较均一。从图3b可以看出,纳米颗粒的尺寸在110 nm左右,且分布均匀。一个P(DO3A-Gd3+)纳米颗粒由单个超支化聚合物纳米颗粒P(DO3A)螯合若干Gd3+构成,无需自组装,因此呈单分散状态且形貌比较均一。Gd3+能稳定鳌合在纳米颗粒内部,不易泄露,因此相对于小分子造影剂,P(DO3A-Gd3+)具有更好的稳定性。均一的纳米尺寸能够提高P(DO3A-Gd3+)的细胞摄取性,延长其在体内的循环时间。
2.3 P(DO3A-Gd3+)的安全性分析
P(DO3A-Gd3+)的细胞安全性用MTT法进行衡量,如图4所示。
图4 P(DO3A-Gd3+)的细胞安全性MTT法衡量
从图4a可以看出,当P(DO3A-Gd3+)的质量浓度大于200 μg/mL时,4T1细胞相对细胞活性仍然高于95%,表明P(DO3A-Gd3+)具有很高的细胞安全性。
从图4b可以看出,在相同环境下培养14 d内,注射P(DO3A-Gd3+)的小鼠与未处理的正常小鼠体质量没出现明显差别。在实验过程中,2组小鼠生理状况良好,全部存活,表明P(DO3A-Gd3+)具有良好的生物安全性。
2.4 P(DO3A-Gd3+)的体外弛豫率
P(DO3A-Gd3+)的体外T1加权图像和P(DO3A-Gd3+)、Magnevist的弛豫率r1拟合图如图5所示。
图5 P(DO3A-Gd3+)的体外T1加权图像和弛豫率r1拟合图
体外MRI成像结果表明P(DO3A-Gd3+)有显著的MRI增强效果;P(DO3A-Gd3+)的弛豫率为5.3(mmol/L)-1·s-1,比临床造影剂Magnevist(约2.94(mmol/L)-1·s-1)的高,表明P(DO3A-Gd3+)弛豫性能更强,从而能够在一定程度上降低用药量,有良好的临床应用前景。P(DO3A-Gd3+)中亲水的POEGMA和内部交联纳米结构能够有效地提高造影剂的水交换速率,进而提高弛豫率[13-14]。
2.5 P(DO3A-Gd3+)的体内MRI成像
为进一步验证P(DO3A-Gd3+)在体内的造影增强效果,采用尾静脉注射法将P(DO3A-Gd3+)注射到已长出肿瘤的老鼠体内,在不同时间点对老鼠的肿瘤部位进行MRI扫描。不同时间点的T1加权图像如图6所示。从图6可以看出,在注射P(DO3A-Gd3+)60 min后肿瘤部位明显变亮,120 min后仍然具有明显的造影效果,表明P(DO3A-Gd3+)具有很好的MRI造影功能。
图6 肿瘤鼠在注射P(DO3A-Gd3+)后体内T1加权图像
本文通过可逆加成-断裂链转移聚合方法合成了一种不需要复杂自组装的两亲性支化共聚物纳米颗粒(PEGDMA-n-BMA-OEGMA-HEMA-DO3A),以该共聚物作为基体鳌合GdCl3·6H2O,制备了一种新型的聚合物MRI纳米造影剂P(DO3A-Gd3+)并对其性能进行表征。其结构与尺寸测试结果表明,P(DO3A-Gd3+)纳米结构稳定;细胞安全性以及生物安全性测试结果表明,P(DO3A-Gd3+)具有良好的生物安全性;体外弛豫率测试结果表明,P(DO3A-Gd3+)具有很好的MRI造影增强效果。P(DO3A-Gd3+)的合成方法简单,可大量制备,相比于临床造影剂有更好的弛豫性能以及稳定性,同时体内循环时间更长、用药量更低,有向临床转化的潜力。
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