马小梅，宋亚倩，罗瑞明
（宁夏大学食品与葡萄酒学院 银川 750021）
中国的绵羊饲养历史悠久，绵羊存栏数、品种遗传资源较多。据《国家畜禽遗传资源品种名录（2021年版）》统计，我国绵羊品种或遗传资源共有89 个，其中包括44 个地方绵羊品种，32 个培育绵羊品种，13 个引进绵羊品种。整体上来说，中国的绵羊主要有藏系绵羊、蒙古系绵羊以及哈萨克系绵羊[1]。藏绵羊作为我国西北地区特有的羊种，主要分布在西藏、青海、四川、甘肃等地区，由于常年生活在平均海拔3 000 m 以上的高寒、低氧地区，造就了藏绵羊耐寒、耐粗饲、抗病等优点[2]。滩羊是宁夏特色优势畜种，是一种极其珍贵的动物资源，特定的自然生态环境赋予了滩羊肉鲜香、细嫩，不膻、不腥等优良品质[3-4]。新疆细毛羊属毛、肉兼用细毛羊，产于新疆巩乃斯种羊场，是新中国成立以来育成的第一个毛、肉兼用细毛羊品种[5]。
滩羊（Tan sheep）系蒙古羊的一个分支，属于短脂尾绵羊，是中国珍贵的绵羊品种。其肉质细嫩鲜美，营养丰富，风味独特且含脂率低，不膻不腥，是公认的优质羊肉之一。与其它羊肉相比，滩羊肉具有独特风味与口感；
且营养成分结构明显优于其它品种羊肉。
近年来，以其它品种羊肉冒充滩羊肉的现象屡屡发生。这不仅侵犯了消费者权益，更阻碍了滩羊肉产业的稳定健康发展。研发快速、准确鉴别滩羊及其它品种绵羊肉的分子标记技术，是滩羊产业发展亟需解决的技术问题。
表达序列标签（Expressed sequence tags，EST）是分子标记的重要工具，基于EST 序列开发的SSR 称为表达序列标签SSR（EST-SSR）。ESTSSR 作为表达基因的一部分，不仅可以对功能基因进行定位[6-7]，而且可以将不同种群或同一种群基因的遗传多态性检测出来，甚至能够在近源物种中实现跨种扩增[8]。迄今为止，虽然已有很多从植物的EST 数据库中筛选微卫星标记的报道，如葡萄[9]、茄子[10]、芦笋[11]、胡萝卜[12]、小麦[13]和松树[14]等，但是基于EST-SSR 标记方法对于动物物种的研究较少，目前仅发现在鲤鱼、草鱼、黄鳝、鲇鱼、牛、虾等和昆虫的报道。
本文旨在利用现有绵羊EST 数据库资源开发EST-SSR 标记，并对开发的EST-SSR 的分布情况、碱基组成、碱基类型等方面进行生物信息分析。采用PCR 技术和毛细管电泳技术，筛选出对宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊有效区分的特异性引物。科学、准确地判断不同绵羊肉的品种，对于不同绵羊的种质资源保护以及科学开发利用均具有重要指导意义。
1.1 材料与试剂
试验所用纯种宁夏滩羊的肝脏来自大夏牧场（宁夏盐池县），纯种藏绵羊和纯种新疆细毛羊的肝脏来自天祝藏族自治县鑫荣盛生态养殖有限公司（甘肃省武威市）。
Taq Plus DNA 聚合酶、10X PCR 缓冲液（含Mg2+）、dNTP（10 mmol/L）、引物、DNA 快速抽提试剂盒，生工生物；
6×DNA 负载染料、DNA 阶梯混合、POP-7TM聚合物、二甲酰胺，Thermo Fisher 公司。
1.2 仪器与设备
PCR 仪、测序仪，美国ABI 公司；
凝胶成像仪，上海复日科技有限公司；
BP 系列精密单道可调移液器，加拿大BBI 公司；
UV-Vis Spectrophotometer，Merinton 公司；
TLTERTEK BERTHOLD 微量核酸蛋白浓度测定仪，美国Bio-Rad 公司。
1.3 方法
1.3.1 样品制备 采用典型集群的简单随机抽样方法进行采样，采样过程中注意避免采集杂交群体及外源性污染。其中宁夏滩羊、藏绵羊和新疆细毛羊各20 只，分别多点取样，每只绵羊肝脏样本为25 g，采样完成后将样本分装标记，共计60 个样本。
1.3.2 DNA 提取 采用动物基因组DNA 快速抽提试剂盒[15]提取DNA，通过核酸蛋白浓度测定仪和1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA 质量。加入50～100 μL 的TE 缓冲液溶解DNA 沉淀，-20 ℃保存DNA 样品。
1.3.3 绵羊EST-SSR 的查找与筛选 根据NCBI系统中的绵羊EST 数据库，应用SSR Finder 软件在线查EST-SSR 位点，查找中使用的标准是[16]：单、二、三、四及五核苷酸的重复次数分别为7，7，6，5，4；
同时包括复合型微卫星序列。此外，引物序列含量一般表现为上、下游引物的含量不能相差太大[17]。
1.3.4 EST-SSR 引物设计合成 使用Primer 3.0进行引物设计[18]，原则如下：引物长度控制在18～24 bp 之间；
GC 含量在40%～60%；
熔解温度（Tm）控制在50～65 ℃；
产物的长度控制在100～350 bp之间[19]；
两条引物的长度差别不应该太大[20]。引物之间尽量避免发夹结构或二聚体；
引物之间应是低互补性或无互补性[21]。随机筛选出100 条ESTSSR 引物，以3 个绵羊的肝脏DNA 为模板进行PCR 扩增。
1.3.5 EST-SSR 扩增和毛细管电泳 PCR 反应体系和反应条件分别见表1 和表2。
表1 聚合酶链式反应体系Table 1 PCR reaction system
表2 聚合酶链式反应条件Table 2 The programs of PCR
对获得的EST-SSR 引物进行荧光标记和PCR 扩增，扩增产物经毛细管电泳检测和STR 分型。使用基因组分析仪分析数据，导出每对引物的峰图文件，筛选出有一定多态性且有明显特征峰的微卫星标记引物[22]。
1.3.6 特异性引物的有效性与适用性检验 对筛选出的特异性引物进行有效性与适用性验证。选用3 个纯种绵羊品种各5 只，分别对其肝脏与肌肉进行多点采样，每个样本25 g，采后将不同品种分装标记，共计30 个样本。宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊的肝脏及肌肉分别标记为L1-5、L6-10、L11-15 和M1-5、M6-10 以及M11-15。提取3 个绵羊品种的不同部位DNA，用特异性引物进行PCR 扩增和毛细管电泳分析。
2.1 DNA 质量评估
A260/A280 用于评估核酸样品的纯度[23]：纯净的样品比值应大于1.80[24]。试验中样本所提取的全基因组DNA 的质量浓度为（128.4±0.01）ng/μL，总量为50 μL，样本A260/A280 比值为1.84±0.01，且凝胶电泳条带清晰无拖尾（图1），表明DNA 质量良好。
图1 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.1 The electrophoresis results of DNA
2.2 EST-SSR 位点分布结果
使用MISA 检测序列中的EST-SSR 位点，结果得出：共计3 193 个有效EST-SSR 位点序列，长度为150～3 628 bp 不等。通过表3 得出单、二、三、四、五核苷酸和复合SSR 重复序列个数和占比分别为834（26.12%），14（0.44%），7（0.22%），1（0.03%），3（0.09%）个和2 334（73.10%）个，结果说明绵羊EST-SSR 的优势基序重复类型是复合碱基；
然而相比其它重复类型，单核苷酸占比相对较高。
表3 绵羊基因组EST-SSR 重复单元分布特征Table 3 Distribution characteristics of EST-SSR repeat units in sheep genome
由图2 可得，c 和c* 类型即复合SSR 的占比最高。观察分析2 334 个复合SSR 重复序列发现，复合SSR 重复序列具有更大的SSR 长度[25]，而且种类丰富，要远远高于非复合SSR。主要组合形式包括（CC）6（C）12*、（A）12（AA）6*、（C）12（CC）6*、（AA）6（A）12*和（A）13（AA）6*等。此结果进一步验证了在EST-SSR 位点重复类型规律上，多数物种中还是以复合SSR 类型为主[22]，且不同的搜索标准和数据库的完整性都会对EST-SSR 的出现频率产生影响[26-27]。
图2 绵羊基因组EST-SSR 重复单元分布图Fig.2 Distribution map of the EST-SSR repeat units in the sheep genome
2.3 3 种绵羊EST-SSR 引物的筛选
经PCR 扩增及毛细管电泳检测结果发现，50对引物中，只有4 对EST-SSR 引物成功扩增出稳定条带，4 对引物详细信息见表4。
表4 EST-SSR 引物信息Table 4 Primer information for EST-SSR
2.4 3 种绵羊EST-SSR 引物的特异性分析
通过对3 个品种绵羊的50 个EST-SSR 引物的峰图进行分析，有3 对引物能够产生高度特异性扩增片段，可以用于区分3 个绵羊肉品种。图3、图4、图5 分别是使用引物p2105.1：248-559、p2025.1：896-1059 和p2104.1：704-1015 的宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊的毛细管电泳结果。
2.4.1 宁夏滩羊引物特异性分析 由图3 可知，使用引物p2105.1：248-559 的宁夏滩羊毛细管电泳结果有两个明显的特征峰，特征值大小为106.27 bp 和124.32 bp；
而新疆细毛羊和藏绵羊均只有一个特征峰，特征数据大小分别为123.28 bp和123.32 bp。由此可见：p2105.1：248-559 对宁夏滩羊源性肉特异性良好，可将滩羊与另外两绵羊品种进行区分。
图3 绵羊基因组p2105.1：248-559 位点SSR 电泳图Fig.3 The electrophoresis results of SSR of p2105.1：248-559 site of sheep genomic
2.4.2 新疆细毛羊引物特异性分析 由图4 可知，使用引物p2025.1：896-1059 的新疆细毛羊的特征值大小为158.77 bp；
宁夏滩羊的特征数据大小为120.27 bp；
藏绵羊的特征数据大小为129.42 bp 和124.13 bp。由此可见：p2025.1：896-1059 可将新疆细毛羊与宁夏滩羊和藏绵羊进行区分。
图4 绵羊基因组p2025.1：896-1059 位点SSR 电泳图Fig.4 The electrophoresis results of SSR of p2025.1：896-1059 site of sheep genomic
2.4.3 藏绵羊引物特异性分析 由图5 可知，使用引物p2104.1：704-1015 的藏绵羊只有一个特征峰，特征值大小为153.06 bp；
对新疆细毛羊和宁夏滩羊均有两个特征峰，特征值大小分别为116.64，134.31 bp 和116.63，132.92 bp。由此可见：p2104.1：704-1015 对藏绵羊源性肉特异性良好，可以对藏绵羊与另外两绵羊进行区分。
图5 绵羊基因组p2104.1：704-1051 位点SSR 电泳图Fig.5 The electrophoresis results of SSR of p2104.1：704-1051 site of sheep genomic
2.5 特异性引物的有效性与适用性检验结果
2.5.1 DNA 质量评估 对3 种绵羊的肝脏和肌肉DNA 进行质量评估，结果显示：肌肉DNA 的A260/A280 比值为1.80 ± 0.04，肝脏DNA 的A260/A280 比值为1.82±0.03，表明DNA 质量良好。所提取肌肉DNA 的质量浓度为（125.6±0.02）ng/μL，总量50 μL；
肝脏DNA 的质量浓度为（128.9±0.01）ng/μL，总量50 μL。由此可知，在相同体积下，肝脏DNA 的质量浓度更高。本试验结果与前人研究结果一致[28-29]。
2.5.2 EST-SSR 3 条引物的毛细管电泳检测结果
2.5.2.1 宁夏滩羊 将提取的宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊肝脏DNA 用引物p2105.1：248-559分别扩增后，进行毛细管电泳检测。结果显示，引物p2105.1：248-559 对宁夏滩羊有两个特征峰，特征值均在106 bp 和114 bp 上下波动；
对于藏绵羊和新疆细毛羊都只有一个特征峰，特征值在120 bp 上下波动，充分说明引物p2105.1：248-559能够检测到其中L1～5，共5 只绵羊为宁夏滩羊（表5）。将提取的宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊肌肉DNA 用引物p2105.1：248-559 分别扩增并进行毛细管电泳检测，发现引物p2105.1：248-559同样对宁夏滩羊有两个特征峰，对于藏绵羊和新疆细毛羊都只有一个特征峰，且对于3 种绵羊肉的肌肉鉴别结果的特征值合理，能够成功检测到其中M1～5，共5 只绵羊为宁夏滩羊（表5）；
验证结果与试验前的形态学标记一致。
2.5.2.2 新疆细毛羊 将提取的新疆细毛羊、宁夏滩羊和藏绵羊肝脏DNA 用引物p2025.1：896-1059 分别扩增后，进行毛细管电泳检测。结果显示，引物p2025.1：896-1059 对新疆细毛羊的特征值在158 bp 的范围内，对于宁夏滩羊的特征值在120.27 bp；
藏绵羊的特征值在129 bp 和124 bp 范围内，特征值有明显差异，因此p2025.1：896-1059引物能够检测到其中L6～10，共5 只绵羊为新疆细毛羊（表5）。将提取的宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊肌肉DNA 用引物p2025.1：896-1059 分别扩增并进行毛细管电泳检测。结果发现，引物p2025.1：896-1059 对于新疆细毛羊、宁夏滩羊和藏绵羊的肌肉DNA 的特征值波动合理，说明p2025.1：896-1059 荧光引物有良好的鉴别范围，能够检测到其中M6～10，共5 只绵羊为新疆细毛羊（表5）；
试验结果与实验前的形态学标记结果一致。
2.5.2.3 藏绵羊 将提取的藏绵羊、宁夏滩羊和新疆细毛羊肝脏DNA 用引物p2104.1：704-1015分别扩增后，进行毛细管电泳检测。毛细管电泳的峰图显示，引物p2104.1：704-1015 对于藏绵羊只有一个特征峰，特征值均在153 bp 的范围内上下波动；
对于宁夏滩羊和新疆细毛羊都有两个特征峰，两个特征峰的特征值都在116 bp 和132 bp 范围内浮动，提示引物p2104.1：704-1015 能够检测到其中L11～15，共5 只绵羊为藏绵羊（表5）。将提取的宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊肌肉DNA 用引物p2104.1：704-1015 分别扩增后，进行毛细管电泳检测，发现引物p2104.1：704-1015 对于肌肉样本的峰的数量和特征值均与肝脏样本一致，可以得出荧光引物p2104.1：704-1015 能够检测到M11～15 共5 只绵羊为藏绵羊（表5）；
此验证结果与试验前的形态学标记结果一致。
表5 EST-SSR 引物验证结果Table 5 EST-SSR primer verification results
此验证结果表明通过EST-SSR 方法获得的荧光引物p2105.1：248-559、p2025.1：896-105 和p2104.1：704-1015 分别对宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊特异性良好，可对3 种绵羊肉品种进行区分。
本文采用Rapid Animal Genomic DNA Isolation Kit 试剂盒提取宁夏滩羊、新疆细毛羊和藏绵羊的肝脏DNA，并以EST 数据库为基础，通过SSR Finder 软件及MISA 技术检测序列中的EST-SSR 位点。Fast QC 可视化SSR 位点结果显示，共计3 193 个有效EST-SSR 位点序列，其中复合SSR 重复序列（73.10%）>单核苷酸（26.12%）>二核苷酸（0.44%）>三核苷酸（0.22%）>五核苷酸（0.09%）>四核苷酸（0.03%），说明绵羊EST-SSR的优势序列重复类型为复合SSR 重复序列。使用毛细管电泳检测SSR 分型，发现引物p2105.1：248-559、p2104.1：704-1015 和p2104.1：704-1015 分别对3 种绵羊肉特异性良好，能够实现对此3 种绵羊肉的有效区分。将EST-SSR 标记技术应用于宁夏滩羊肉、新疆细毛羊肉和藏绵羊肉的鉴别中，成功验证了3 条引物的有效性与适用性，这对于地方绵羊品种遗传资源的开发利用、品种鉴别及丰富分子标记类型具有重要的意义。
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