潘鹏宇，韩金泽，殷建豪，谢艾伶，吴凤明，刘鼎阔，孙英峰，尤春雪，于晓雪*，李留安*
(1.天津农学院动物医学与动物科学学院 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300392；
2.天津市广源畜禽养殖有限公司，天津 301806；
3.鼎正新兴生物技(天津)有限公司 天津市生物饲料添加剂企业重点实验室，天津 300383)
鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由IBDV引起的高度传染性的免疫抑制性疾病[1,2]。该病使3周龄～12周龄雏鸡法氏囊萎缩甚至坏死，鸡只严重免疫抑制或死亡，对世界养禽业造成威胁。疫苗接种是预防该病的最有效措施。B87株IBDV是我国广泛使用的IBDV疫苗株，该疫苗通过接种SPF鸡胚，收获感染鸡胚，经研磨、添加适宜稳定剂、冷冻真空干燥等步骤制备，但生产工艺繁杂，成本较高。DF-1细胞和Vero细胞是能无限繁殖的细胞系，广泛应用于多种病毒增殖、重组蛋白表达、动物与人类病毒病疫苗生产等领域。本试验使用IBDV B87株感染DF-1细胞和Vero细胞，利用免疫荧光法、实时荧光定量PCR等比较两种细胞对病毒的易感性，旨在为IBD疫苗规模化生产筛选合适细胞系奠定基础。
1.1 材料
1.1.1 细胞系与毒株 DF-1细胞和Vero细胞，保存于天津农学院兽医学实验室；
IBDV活疫苗株B87，青岛易邦生物工程有限公司产品。
1.1.2 主要试剂 RNAprep pure总RNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司产品；
DMEM培养基，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；
青链霉素混合液、1×PBS缓冲液、DAPI溶液，北京索莱宝科技有限公司产品；
Bovine Serum Albumin、FITC标记山羊抗鸡lgY，西格玛集团有限公司产品；
All-in-OneTMFirst-Stand cDNA Synthesis Kit，美国GeneCopoeia(中国)广州复能基因有限公司产品；
Anti-dsRNA mAb SCICONS J2(IgG2a)，北京康为世纪生物科技有限公司产品；
FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，上海碧云天生物技术有限公司产品；
抗IBDV鸡血清，保存于天津农学院兽医学试验室。
1.1.3 主要仪器 实时荧光定量PCR仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品；
温度梯度定量PCR仪，美国艾尔特公司(ALT)产品；
超微量分光光度计，香港基因有限公司产品；
正置倒置一体荧光显微镜，美国EchoLaboratories公司产品。
1.2 方法
1.2.1 CPE观察比较 DF-1细胞、Vero细胞接种至细胞培养板，每种细胞3个重复孔，37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养。待细胞生长至70%～80%后接种IBDV疫苗株B87(MOI=1)，24 h后观察并记录CPE。
1.2.2 免疫荧光检测 细胞爬片经无水乙醇超声30 min，高温蒸汽灭菌并烘干后，置24孔细胞培养板内，分别接种相同细胞量DF-1细胞和Vero细胞，细胞生长至70%～80%接种IBDV疫苗株B87，培养24 h，PBS清洗3次；
40 mg/L多聚甲醛固定35 min，弃固定液，PBS清洗3次；
1 mL/L Triton X-100 PBS室温通透7 min，PBS清洗3次，50 g/L BSA封闭2 h。
J2抗体(dsRNA单克隆抗体，1∶500稀释)或抗IBDV鸡血清孵育1.5 h，PBS清洗2次～3次；
FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体或FITC标记山羊抗鸡lgY抗体孵育1 h，PBS清洗3次；
DAPI染色液(1∶1 000稀释)孵育5 min，PBS清洗4次；
爬片取出后加入抗淬灭性溶剂封片，晾干后荧光显微镜观察。
1.2.3 TCID50检测 IBDV疫苗株B87感染DF-1或Vero细胞(MOI=0.1)24 h后，反复冻融3次，离心，取上清液测定TCID50。
DF-1细胞、Vero细胞分别接种至96孔细胞培养板内，生长至70%～80%后，DMEM维持液(20 mL/L胎牛血清，10 mL/L双抗)10倍系列稀释待测病毒液，每个稀释度3个重复，取1×10-1～1×10-88个稀释度病毒液加入96孔细胞培养板内，对照组只加维持液100 μL/孔，37℃、体积分数为5% CO2培养箱培养4 d后进行IFA检测。
弃96孔板培养液，PBS清洗3次，40 mg/L多聚甲醛固定，PBS清洗3次，加入抗IBDV鸡血清(1∶500稀释)，25 μL/孔，4℃过夜；
次日，PBS清洗3次，FITC-标记羊抗鸡lgY抗体(1∶1 000稀释)孵育1 h，PBS清洗3次，置荧光显微镜下观察记录阳性孔，Reed-Muench法计算TCID50。
1.2.4VP2基因表达量检测 参照文献[3-4]报道的引物序列合成实时荧光定量PCR引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。IBDV B87株感染DF-1细胞、Vero细胞24 h后，PBS清洗2次，加入350 μL Trizol裂解液，涡旋振荡，12 000 r/min离心2 min；
取上清加入等量700 mL/L乙醇溶液，12 000 r/min离心1 min；
弃上清加入350 μL去蛋白液，12 000 r/min离心1 min；
弃上清加入80 μL DNaseI工作液室温静置15 min；
加入350 μL去蛋白液，12 000 r/min离心1 min；
弃上清，加入500 μL漂洗液静置2 min，12 000 r/min离心1 min；
反复操作2次后室温放置晾干，加50 μL RNase-Free ddH2O。根据反转录试剂盒说明书合成cDNA，置-20℃保存待用。以获得的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，15 μL PCR反应体系包括：2×All-in-OneTMqPCR Mix 7.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板5.5 μL。反应条件为：95℃ 60 min；
95℃ 15 s，55℃ 1 min，共40个循环；
72℃ 15 s。
表1 引物序列信息
1.2.5 数据统计 采用spss23.0软件独立样本t检验进行数据的差异显著性统计分析，所有数据以“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2.1 IBDV B87株感染DF-1细胞和Vero细胞CPE程度对比
IBDV B87株分别感染DF-1细胞与Vero细胞，24 h后观察CPE，可见未接毒的DF-1细胞与Vero细胞为成纤维状贴壁，细胞形态为梭形。接毒后，两种细胞均出现细胞病变现象，细胞形态改变，发生皱缩脱落，与DF-1细胞相比，Vero细胞CPE程度低于DF-1细胞(图1)。
A.DF-1细胞未攻毒组；
B.DF-1细胞攻毒组；
C.Vero细胞未攻毒组；
D.Vero细胞攻毒组
2.2 IBDV B87株感染DF-1细胞和Vero细胞中病毒基因组dsRNA对比
图2和图3显示，DF-1细胞(图2D～图2F)中绿色荧光强度高于Vero细胞中(图2A～图2C)的荧光强度，且差异显著(P<0.05)。说明DF-1细胞对IBDV B87株易感性强于Vero细胞，且dsRNA在两种细胞中有相似的细胞质定位。
图2 IFA检测IBDV B87株感染DF-1细胞与Vero细胞中基因组dsRNA水平(10×)
图3 IBDV B87株感染DF-1细胞与Vero细胞中基因组dsRNA荧光强度水平
2.3 IBDV B87株感染后DF-1细胞与Vero细胞病毒载量对比
IBDV B87株感染后，DF-1细胞(图4A)中指示病毒量的荧光密度(鸡抗IBDV血清标记)高于Vero细胞(图4B)。DF-1细胞的病毒滴度(105.423±0.03296TCID50/0.1 mL)极显著高于Vero细胞中病毒滴度(102.592±0.03428TCID50/0.1 mL，P<0.01)(图5A)，且DF-1细胞VP2基因表达量显著高于Vero细胞(图5B)(P<0.05)。此结果表明，IBDV B87株对DF-1细胞中病毒侵染能力显著高于Vero细胞中，表明DF-1细胞对IBDV的易感性更强。
A.IFA检测IBDV B87株感染DF-1细胞病毒量；
B.IFA检测IBDV B87株感染Vero细胞病毒量
*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)
IBD的防控主要通过接种IBD疫苗实现。以IBDV活疫苗株B87生产的疫苗是我国家禽养殖中常用的疫苗之一，通常是接种易感SPF鸡胚制备而成，成本较高，因此寻求高效增殖IBDV方式、降低疫苗生产成本具有重要意义。DF-1细胞和Vero细胞是疫苗研制、病毒增殖、病毒致病机理探究等领域常用细胞系。研究发现IBDV HQ株在DF-1细胞中可大量增殖[5]。Vero细胞是具有无限增殖能力的非洲绿猴肾脏上皮细胞[6]，已报道对 IBDV BJ836株高度敏感[7]。虽然IBDV可天然靶向未成熟的鸡法氏囊B淋巴细胞，但IBDV弱毒株也能在DF-1细胞、Vero细胞中体外增殖[8]。本试验以相同感染复数的IBDV疫苗株B87感染DF-1细胞和Vero细胞，发现其在DF-1细胞中感染性更强，表明较Vero细胞而言，DF-1细胞更适用于进行IBDV疫苗株B87增殖，未来将开展试验对比DF-1细胞和SPF鸡胚增殖该疫苗株效率，为替代鸡胚进行疫苗生产、降低成本提供参考。
IBDV侵染宿主细胞时表现出明显的细胞嗜性差异。细胞嗜性的差异主要是由于不同宿主细胞受体介导引起的，目前已知的受体主要包括SlgM免疫球蛋白、热休克蛋白90、整合素α4β1、Toll样受体等。除此以外，VP2为IBDV主要结构蛋白，可影响病毒的功能，也与IBDV毒力和细胞嗜性相关[8-9]，其氨基酸位点Q253H、D279N及A284T被认为是决定IBDV细胞嗜性的分子基础[10-11]。有研究证明，Q253H和A284T双突变毒株可在CEF中有效复制，定点突变vvIBDV P07突变株D279N可使IBDV适应鸡胚成纤维细胞生长，引起细胞嗜性的改变[12-13]。本研究检测到DF-1细胞中VP2基因表达量显著高于Vero细胞，说明IBDV疫苗株B87在DF-1细胞与Vero细胞中的增殖表现出细胞嗜性差异。病毒滴度方面，DF-1细胞中病毒载量更高，也说明该细胞系对IBDV疫苗株B87的易感性更强。IBDV疫苗株B87感染两种细胞系表现出不同的增殖效果，一方面可能是毒株在不同细胞中的细胞嗜性差异所造成，另一方面可能是由于DF-1细胞与Vero细胞中的IBDV受体存在差异，造成病毒吸附、侵入及增殖作用不同，这些需要更多的试验证据。
本研究结果表明，与Vero细胞相比，IBDV疫苗株B87在DF-1细胞中感染性更强，提示DF-1细胞可作为工具细胞进行IBDV增殖及致病机理研究。
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