徐 艺，姚 月，余 良*
(1.哈尔滨医科大学附属第二医院 肝胆胰外科，黑龙江 哈尔滨 150001；
2.香港大学 病理学系，香港 999077)
外泌体是由细胞分泌至胞外的纳米级囊泡。近年来，随着研究逐渐深入，外泌体被认为是细胞生命活动中的“多余物质”的偏见逐渐消除[1]。目前，有关外泌体的“信使”作用、疾病进展作用、生物标志物作用以及载药工具等的研究逐渐兴起。然而，这些探索是以完成稳定、高效、高纯度的外泌体分离提取为前提的。这也是当前制约该领域进展的重要技术难题。Tang等[2]对同一样品实施不同的提取方案，得到的外泌体中有588个共存交集的miRNA和200个仅在各自方案中存在的miRNA，说明不同的提取方案所得的外泌体存在纯度差异。客观上，外泌体的平均直径、内容物、功能及来源也增加了外泌体提取工作的难度[3]。
目前，普遍认为外泌体是通过内体途径形成的细胞外囊泡的一个亚类，直径约30～150 nm[4]。在电镜下，外泌体由于在样本制备过程中脱水塌陷而呈现出典型的茶托样形态，呈扁球状[4-5]。其表面存在独特的跨膜标志蛋白CD63，CD9等常用于对所提取的外泌体进行鉴定[6]。依据外泌体的大小、形态、表面标志物等特征，超速离心法、超滤法、亲合法等外泌体提取方法被应用在不同研究场景中。本文对目前主要的外泌体提取方法的基本原理、优势及缺陷、技术进展等进行归纳与总结，旨在为研究者提供参考借鉴。
Johnstone等[7]首次在网织红细胞培养基中提取外泌体时采用了超速离心法。经过不断改进，目前超过80%的研究者选择超速离心法提取外泌体[8]。超速离心法以不同的离心力或离心时间循环，逐步淘汰较大的颗粒，最终得到底部沉淀的外泌体，主要分为2个步骤，首先以中低速离心去除死亡细胞、细胞碎片、大型囊泡的沉淀，然后以100 000 g离心分离得到外泌体沉淀[9]。超速离心法因不受分离试剂污染，外泌体获取量较大，方法相对成熟而受青睐。但是此方法的重复性较差，外泌体易结块，且可能造成外泌体损伤[10]。增加离心时间会显著增加外泌体的获取量，但当时间超过4 h后，外泌体的完整性会被破坏，并且可溶性蛋白杂质含量会升高[11]。
密度梯度离心法可视为更精确的超速离心法。当沉降系数差别不显著时，超速离心法效果不好，此时密度梯度离心法的优势突显。通常以蔗糖为介质构建由上层液面到底部逐渐增加的密度梯度层，外泌体在离心力作用下最终会驻留在与之相似的密度层面，一般介于1.10～1.18 g/mL[12]。该方法的优势在于所得外泌体几乎不含干扰蛋白，但其原理决定了筛选结果为某一类密度近似的囊泡，不可避免地会降低纯度[13]。此外，该方法与超速离心法同样存在设备昂贵、长时间的离心作用影响外泌体的结构与功能等缺点。
考虑上述提取方法的应用限制，超滤法有望起到部分替代作用，即通过膜孔截留直径大于200 nm的粒子，漏过直径小于20 nm的微小囊泡，并通过加压或短时间低速离心等方式加速此过程。该方法在处理大量样本时有优势，可通过设计膜孔的直径来选择特定大小的囊泡，常应用于超速离心法的辅助环节[9,14]，但难以避免外泌体通过膜孔时遭受到切割挤压损伤。切向流过滤法改进了超滤技术的结构，将样本液体的主要流动方向由垂直于滤过膜改为平行于滤过膜，避免了外泌体损伤，同时最大程度降低了膜孔堵塞，增加了滤膜的使用寿命[15]。通过循环反复过滤可获得更高纯度的外泌体，可应用于外泌体的工业化制备。Gao等[16]对比了超滤法与ExoQuick-TC(以聚合物沉淀法为原理的外泌体提取试剂盒)提取脂肪组织的外泌体的质量参数，发现二者在促进成纤维细胞增殖迁移能力方面没有明显区别，但超滤法所得的外泌体蛋白质含量更高。Shu等[17]将超滤法和尺寸排阻色谱联合用于色素细胞瘤细胞系中提取外泌体。Xiang等[18]为解决尿液外泌体提取时样本量稀疏的难题，采用了超滤联合亲合法(TiO2)，可以在20 min内收集高质量的外泌体。总之，超滤法最初由于简便快速而受到研究者的关注，又由于过滤孔直径的可设计性被进一步开发应用。
体积排阻色谱法(Size-exclusion Chromatography，SEC)同样是依据外泌体的尺径/体积特性通过分离基质分离不同体积的颗粒，即经PBS洗脱后，大体积的分子或颗粒无法进入分离基质而直接从快速通道提前流出，而外泌体因体积小可以进入既定设计的固相分离基质中，并在其中移动更长的距离发生相对滞留，因而与前者存在流出时间差，以此分离提取外泌体[19]。其原理已相对成熟，更新的技术点主要在于分离基质的选择。Xu等[20]评估了若干商用SEC分离株提取外泌体的效率，发现SepharoseCL-4B基质的分离效率与分离质量最佳。Guo等[21]证实了SepharoseCL-6B基质分离蛋白血清外切体的效果优于CL-4B和CL-2B基质。此外，值得关注的是，SEC在提取脂肪细胞来源外泌体方面表现突出。由于脂肪细胞的组织或细胞上清液富含脂质而影响外泌体的密度，常规的提取方案往往不甚理想，SEV联合超速离心可高效率提取脂肪组织或细胞来源外泌体[22]。SEV仅受重力作用而移动，外泌体结构几乎不受损伤，所得产物纯度高且不受杂质影响，最先进入外泌体提取试剂盒的商业化领域。但是，该方法可能掺杂一些尺寸类似的囊泡[23]，同时也面临洗脱液对样品的稀释效应，需要使用者关注。
亲和法针对外泌体表面特有的抗原，通常选择外膜表面的高丰度蛋白(如四跨膜蛋白超家族、ESCRT复合体相关蛋白等[24])以固相抗体吸附外泌体表面抗原提取外泌体。从原理上来看，此方法获取外泌体的特异性最强[25]，甚至可通过选择特殊的抗体对不同来源的外泌体加以分选，因此在基于外泌体的疾病诊断平台中具有广阔应用前景[26]。Ning等[27]使用该方法通过抗体与外泌体表面蛋白CD81相互作用，直接从血浆中提取外泌体，在动物模型中发现在SARS-CoV-2 感染1 d后即可通过血浆外泌体检测到阳性结果。Nakai等[28]利用亲合法以外泌体结合分子Tim4蛋白分离外泌体，将固定在磁珠上的Tim4与外泌体表面的磷脂酰丝氨酸从样品中提取出来。该方案的提取效率显著高于超速离心法。研究表明，在提取血清外泌体时可获取同样的RNA量[29]。相对于超速离心法，亲合法只需要其总样本量的1/6，耗时仅为其1/16[30]。但是，外泌体的生物学功能是否受抗体影响有待进一步探讨，且获取的外泌体的保存条件比较苛刻，限制了其广泛应用。
聚合物的共沉淀法又称“沉淀法”，其原理为通过聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)“劫持”外泌体表面的水分子，降低外泌体溶解度，从而易于沉降分离[31]。该方法最早用于提取病毒，因外泌体与病毒大小相似而沿用至今[32]。样品需首先与分子量为8 000 Da的PEG在4 ℃下孵育8～16 h，然后以低速离心或者过滤的方式完成提取。该方法操作简单，获取率非常高，对样本的体积量几乎没有要求，因此在各类研究中的适用性高[29]。Coughlan等[33]探究了超速离心法和聚合物共沉淀法提取人血浆外泌体的效率，发现后者的速度为前者的6倍，等体积下产量为前者的2.5倍。许多商业化的外泌体提取试剂盒采用该原理进行外泌体收集，如System Biosciences (Palo Alto, CA, USA)公司的外泌体快速提取试剂盒(ExoQuickTM)等。沉淀法所得外泌体的纯度较低，原因是一些可溶蛋白以及其他的细胞外囊泡的表面也存在水分子，在该技术路线下可能污染最终提取的外泌体。Martínez-Greene J等[34]创建了共沉淀法与SEC联合应用的工作流程，提高了外泌体提取的纯度与数量，说明共沉淀法联合其他方案具备更好的临床应用前景。
外泌体活跃于细胞间，广泛参与病理生理过程。目前，外泌体的生成、靶细胞摄取外泌体等过程尚未完全揭示，已知的外泌体的功能与调控机制可能仅是“冰山一角”。甚至在稍早一些的研究中，“外泌体”这一名词的使用存在不规范之处，并未与凋亡小体等囊泡完全区分。与其他领域研究不同的是，外泌体研究的第一步——提取外泌体必须稳定、精确，但尚无一种可以胜任所有研究或应用场景的外泌体提取方案。最理想的技术方案应该是高纯度、无损伤、低成本的，甚至能满足不同种类细胞外囊泡的筛选。显然，目前的技术方案仍在朝着这个方向努力，外泌体的标准化提取流程仍在不断改进。这对稳定控制外泌体质量以及精准计算外泌体的定量，确切分析外泌体在细胞间通信的作用至关重要。
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