方梓鹏，卢晓晴，李志豪，罗伟浩，石现丽
（广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州 510006）
CRISPR/Cas 系统是一种最新的由RNA 指导Cas 核酸酶对靶向基因进行特定编辑的技术。该系统最早发现于细菌中，是细菌对抗噬菌体的一种适应性免疫防御机制。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，规律间隔成簇短回文重复序列），是存在于细菌和古菌基因组内的一段重复序列。Cas 蛋白是一种CRISPR 关联蛋白，是一种核酸内切酶，能与CRISPR基因转录编辑产生的RNA形成蛋白-RNA复合体。该复合体通过RNA 特异识别DNA，产生靶向定位和切割，进而实现靶向基因的敲除或者编辑。在噬菌体感染细菌的过程中，细菌会提取噬菌体的一部分DNA 片段，将其整合储存在CRISPR 位点。之后，细菌会将CRISPR 位点转录加工后的RNA 与Cas 蛋白形成复合物。该复合物可以通过RNA上的特异序列（来自于噬菌体DNA的转录产物）识别再次感染细菌的噬菌体DNA，启动Cas 蛋白对噬菌体DNA 的切割，进而阻止噬菌体在细菌中的增殖[1]。通过张锋团队[2]的改造，目前CRISPR/Cas 系统已经成为非常成熟的基因编辑或基因敲除的工具。本研究所使用的plenti-Crispr V2 系统（Addgene #52961）也是张锋团队在2014 年开发。该质粒包含Crispr sgRNA 和Cas9蛋白等元件，只需根据靶基因的PAM（位点）设计sgRNA 的靶序列，再根据sgRNA 靶序列设计并合成sgRNA 引物，构建plenti-Crispr V2 sgRNA 重组质粒，即可实现基因敲除的目的；
或者在转染plenti-Crispr V2 sgRNA 重组质粒的同时再转染靶基因编码位点对应的同源序列即可实现基因的编辑[2]。
ZNF703 是锌指蛋白家族的成员之一，通过参与组蛋白去乙酰化而抑制转录，属于转录抑制因子；
该蛋白由590 个氨基酸组成，具有1 个C2H2 型锌指结构。ZNF703 位于人类8 号染色体上，而该染色体上的多个基因都与许多肿瘤的发生进展密切相关[3]。ZNF703 已被报道高表达于乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、结肠癌等多种肿瘤中，是一种促癌因子[2，4-8]。但是，目前关于其在肿瘤发生、发展中的功能还不明确。因此，本研究构建plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 质粒，并在HCT-116 细胞系中验证其敲除效果，将有望为在肿瘤细胞中敲除ZNF703基因、探究ZNF703的功能打下基础。
1.1 实验材料
DL500 DNA Marker（TaKaRa，货号：3590A）；
DL15000 DNA Marker（TaKaRa，货号3582A）；
rTaq酶（TaKaRa，货号DR100A）；
10×NEB Buffer 3.1（NEB#B7203S）；
10×Loading Buffer（TaKaRa，货号9157）；
核酸染色剂（Biosharp，BS356A）。
1.2 方法
1.2.1ZNF703 sgRNA 双链寡核苷酸片段的制备根据GFP Web Portal-Home（broadinstitute.org）网页中的CRISPpick 工具设计ZNF703 的靶序列，加上黏性末端合成ZNF703 sgRNA 的前引物和后引物（Forward primer 和Reverse primer，详细设计过程参见结果2.1 部分）。在1.5 mL 的离心管中加入2 μLZNF703 sgRNA 前引物、2 μLZNF703 sgRNA后引物、2 μL 10×T4 Ligation Buffer、14 μL dd H2O，混匀后置于装有1 L 95 ℃热水的烧杯，待自然冷却至室温，完成退火，得到ZNF703 sgRNA双链寡核苷酸片段。
1.2.2 plenti-CrisprV2 质粒酶切回收在1.5 mL离心管中加入2.5 μL 10×NEB Buffer（r 3.1）、1 μL 1×BsmBI酶、21.5 μL plenti-Crispr V2 质粒配制酶切体系，混匀后放置55 ℃水浴过夜。用1%琼脂糖凝胶分离酶切产物，取6 μL DL15000 Marker、25 μL 酶切体系分别加入1 μL 和2.5 μL 核酸染料（SYBR Gold，Thermo Fisher，货号：S11494），混匀上样，电泳至适当位置后，紫外凝胶成像仪（北京赛智创业科技有限公司创，SmartGel 6000）照胶，切取目的片段（12 988 bp），使用DNA 纯化试剂盒（天根试剂盒DNA 纯化胶回收试剂盒DP214）回收目的片段（12 988 bp）。
1.2.3 连接、转化和克隆鉴定 在1.5 mL 离心管中配制连接体系：2 μL plenti-Crispr V2 酶切回收片段（12 988 bp）、4 μLZNF703 sgRNA 双链寡核苷酸片段、1 μL T4 Buffer、0.8 μL T4 DNA Ligase、2.2 μL dd H2O，混匀放置室温2 h。连接体系中加入100 μL DH5α感受态细胞，冰浴15 min，42 ℃水浴热击90 s，再冰浴10 min；
加入200 μL LB 培养基，37 ℃220 r/min 摇床中培养1 h；
4 000 r/min，3 min，收集菌液，将菌液均匀涂布在氨苄LB 琼脂平板上，37 ℃，培养过夜。
1.2.4 单克隆鉴定 挑取单克隆，加入500 μL LB 培养基，37 ℃220 r/min 摇床中培养1 h，进行PCR鉴定，PCR 体系如下：12.5 μL rTaq 聚合酶、3 μL Template（单克隆培养得到的菌液）、1 μL 上游引物（Crisp-F）、1 μL 下游引物（Crisp-R）、7.5 μL dd H2O，PCR 条件：95 ℃2 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，30个循环，4 ℃存放；
用2%琼脂糖凝胶鉴定，在25 μL 的PCR 体系和6 μL 的DNA marker 中分别加入2.5 μL 和1 μL 核酸染料，上样，电泳，紫外凝胶成像仪照胶拍照。
1.2.5 测序鉴定 将上述单克隆鉴定阳性的菌种接种到5 mL含有氨苄的LB培养基中，37 ℃220 r/min摇床中培养过夜，利用天根（货号：DP103）质粒小提试剂盒提取质粒，送去生工生物工程公司进行双向测序。测序上游引物是hU6F，测序的下游引物是Crisp-R引物。
1.2.6 细胞培养 利用含有10%（φ）胎牛血清（Invitrogen，10270106）和100 u/mL 青霉素/链霉素（Invitrogen，15140122）的DMEM（Invitrogen，12800017）培养基培养HEK293T，HCT-116 细胞，置于细胞培养箱（5%CO2，37℃）中生长。
1.2.7 构建ZNF703 敲除HCT-116 细胞系 利用脂质体2000（Invitrogen 公司，11668）将构建成功的plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 质粒和psPAX2、PMD2.G 质粒同时转染HEK293T 细胞，包装病毒，分别收取质粒转染后48 h和72 h的病毒。提前1天将HCT-116 细胞按5×106接种到10 cm 细胞培养皿中，培养过夜。病毒、终质量浓度为8 μg/mL 的聚凝胺和新鲜培养基一起加到HCT-116 细胞中，进行感染。感染2 d 后，利用含有5 μg/mL 嘌呤霉素的新鲜培养基进行筛选，筛选2～3 d后，存活下来的阳性细胞系可用于后续的鉴定。
1.2.8 利用q-PCR 验证ZNF703 敲除效果 提前1 d将以上筛选得到的嘌呤霉素阳性的细胞和HCT-116对照细胞按3×105分别种到2 个3 cm 细胞培养皿中。用1×PBS 洗2 次后，分别加入300 μL Trizol（Invitrogen，15596-018），用刮子将细胞刮下来收集到1.5 mL的离心管中，充分裂解后，加入60 μL三氯甲烷，振荡混匀，静置分层，4 ℃条件下12 000g离心20 min ；
取上清，加入等体积异丙醇，室温静置10 min，4 ℃条件下12 000g离心10 min；
弃上清，得到RNA 沉淀。用70%（φ）酒精清洗沉淀2 次，用30 μL DEPC 处理水溶解RNA。使用nanodrop 测定RNA的浓度，使用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒进行反转，取400 ng 总RNA 用于反转录反应用（10 µL 反应体系），同时使用随机引物（Random 6 mers）和oligo dT 引物，反应条件为：37 ℃15 min，85 ℃5 s。使用擎科生物公司的荧光定量PCR试剂2×TSINGKE®Master qPCR Mix（TSE201）进行定量PCR，mRNA 的表达量以GAPDH 作为内参进行相对定量。引物序列如下：
ZNF703 前引物：5′-TTGGGCCTAAGCCGG TAC CAC-3′；
后引物：5′-AGGCTGAAGCTAGTCTCTGT CCA-3′；
GAPDH 前引物：5′-CCATGTTTGTGATGGG TGT GAA CCA-3′；
后引物：5′-ACCAGTGGATGCA GGG ATG ATG TTC-3′
使用ΔΔCt法计算ZNF503 mRNA 的相对表达量，不同组之间或不同基因之间的相对表达量用公式2-ΔΔCt计算。
2.1 ZNF703 sgRNA靶向序列的设计
利用GFP Web Portal-Home（broadinstitute.org）网页中的CRISPpick 工具分别设计靶向人源ZNF703 和鼠源ZNF703 的sgRNA，得到的靶向人源ZNF703和靶向鼠源ZNF703的sgRNA 靶序列列表，取交集部分，再从中选取特异性（specificity）最高、有效性（efficiency）最好的sgRNA 靶序列。人源ZNF703 基因组序列中有2 个外显子，鼠源zfp703（ZNF703 在鼠中的命名）基因组序列中含有3 个外显子，所选取的特异性最高、有效性最好的一条sgRNA 靶序列能靶向人源ZNF703 或鼠源zfp703 基因组中的第一外显子的共同序列，序列如图1B 所示：5′-CCAAGGACACCCGAAAGCAG-3′。再根据plenti-CrisprV2 质粒的操作说明（如图1A），在靶序列的两端分别加上黏性末端（如图1B），得到ZNF703 sgRNA 的引物：前引物（F）：5′-CACCGC CAAGGACACCCGAAAGCAG-3′；
后引物（R）：5′-AAACCTGCTTTCGGGTGTCCTTGGC-3′。将引物送去生工生物公司合成，并进行退火，得到可以直接用于连接的ZNF703 sgRNA 双链寡核苷酸片段。
图1 ZNF703 sgRNA引物设计Figure 1 ZNF703 sgRNA primer design
2.2 plenti-Crispr V2 质粒酶切回收
plenti-Crispr V2质粒的构建需要使用BsmBI限制性内切酶，BsmBI 属于IIs 类的限制性核酸内切酶，会在离它的不对称识别位点（CGTCTC）一侧的下游N1 和N5 切割DNA 双链，产生黏性末端（如图2A）。虽然BsmBI 有特定的识别位点，但是切割位点可以不同，进而可以产生不同的黏性末端。在plenti-Crispr V2 质粒中有2 个不同的BsmBI 酶切位点（如图2B、2C），分别在2 234 bp 和4 119 bp 处，所以用BsmBI 酶切plenti-Crispr V2 可得到2 个条带：12 988 bp 和1 885 bp；
在plenti-Crispr V2 的质粒骨架（12 988 bp）上会产生2 个不同的黏性末端。而与这2 个黏性末端对应的序列，在ZNF703 sgRNA 引物设计的时候已经加到ZNF703 sgRNA靶序列的两端，所以回收的plenti-Crispr V2 的质粒骨架（12 988 bp）可以直接用于构建plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA质粒。图2D显示，BsmBI酶切plenti-Crispr V2 质粒后的1%琼脂糖凝胶电泳图显示得到2 个条带：12 988 bp 和1885 bp，符合预期。本实验切胶回收了12 988 bp的条带。
图2 用BsmB I 酶切回收plenti-Crispr V2质粒Figure 2 Purification of plenti-Crispr V2 backbone after BsmB I digestion
2.3 连接转化得到的阳性克隆
将上述回收的plenti-Crispr V2骨架（12 988 bp）与ZNF703 sgRNA 双链寡核苷酸片段通过T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，并涂于氨苄LB 琼脂平板上，培养过夜后，得到氨苄筛选阳性单克隆菌落。见图3。
图3 plenti-Crispr V2（12 988 bp）骨架和ZNF703 sgRNA双链寡核苷酸片段连接、转化后得到的大肠杆菌阳性克隆Figure 3 Positive clone of E.coli obtained by connecting and transforming the plenti-Crispr V2 (12 988 bp) skeleton and ZNF703 sgRNA double stranded oligonucleotide fragment
2.4 菌落PCR鉴定和酶切鉴定
在重组质粒plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 质粒的sgRNA 序列的上、下游设计菌落PCR 的引物（Crisp-F：5′-GTGGAAAGGACGAAACACCG-3′；
Crisp-R：5′-CTAGGCACCGGATCAATTGC-3′（如图4A））；
用Crisp-F 和Crisp-R引物来扩增含 有ZNF703 sgRNA靶序列的DNA片段（248 bp）。并用2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在上述得到的7个阳性克隆中，只有7号在248 bp处有明显的条带出现（如图4B），初步确认7 号阳性克隆的大肠杆菌中有plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 重组质粒。取7 号大肠杆菌进行培养过夜、提取质粒。为了保证结果的准确性，用提取的plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 质粒再次进行了EcoRⅠ酶切鉴定。在plenti-Crispr V2中只有1个EcoRI酶切位点，且该位点在plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 重组质粒被保存了下来，所以酶切会产生和质粒大小相同的一条带（13 013 bp）（如图4C）。经过以上实验，初步得到了plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA重组质粒。
图4 plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA菌落鉴定Figure 4 Colony identification of plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA by colony-PCR and EcoR I digestion
2.5 质粒测序结果
选择重组质粒plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA质粒的sgRNA序列上游的通用引物hU6F和sgRNA序列下游的Crisp-R引物进行双向测序（引物位置如图5A），测序结果显示ZNF703 sgRNA 靶序列已经成功插入plenti-Crispr V2质粒中。见图5B。
图5 plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA质粒测序Figure 5 Sequencing of the plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA plasmid
2.6 在HCT-116 细胞系中，验证plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA靶向敲除ZNF703的效果
利用慢病毒包装体系构建ZNF703 敲除的HCT-116 细胞系，利用荧光定量PCR 检测敲除效果。q-PCR 结果显示（图6）和对照HCT-116 细胞相比，在ZNF703 敲除HCT-116 细胞系中，ZNF703 的敲除效果在60%以上。结果表明，所构建的plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 可以特异有效地敲除ZNF703。
图6 plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA 靶向敲除ZNF703 的效果Figure 6 Effect of targeted knockout of ZNF703 by plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA
肿瘤已经成为全世界最主要的人类致死原因之一，也是中国居民最主要的死亡原因之一。目前对于肿瘤的治疗方法包括手术切除、化疗、放疗、靶向药物、免疫治疗等，但是由于缺乏有效的早期筛查方法，肿瘤具有复发、转移及对化疗、放疗、靶向药物产生抗药性，以及对免疫治疗临床有效反应率低等，目前肿瘤仍旧是人类亟待攻克的医学难题。因此深入探索肿瘤的发生、发展过程中的分子机制将为肿瘤治疗提供支持。
锌指703（ZNF703）属于NocA/Nlz、Elbow、Tlp-1（NET）家族，是一种高度保守的转录抑制因子。研究表明，ZNF703 和许多种癌症的肿瘤发生和不良预后有关，并且在乳腺癌等多种肿瘤中高表达，能显著提高肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭活性。因此，为了探究ZNF703 在肿瘤中发生、发展、转移、恶化过程中的分子生物功能，本研究利用GPP Web Portal-Home（broadinstitute.org）中的CRISPpick 工具，根据人源ZNF703 或鼠源zfp703 基因序列中的相同部分序列设计ZNF703 sgRNA 靶向序列，该序列可以同时高效靶向人源ZNF703 和鼠源zfp703。并构建plenti-Crispr V2 sgZNF703 重组质粒，利用CRISPR/Cas9 基因编辑工具敲除ZNF703 基因。利用慢病毒包装体系，在HCT-116 细胞中通过构建ZNF703敲除细胞系，并利用荧光定量PCR 技术验证ZNF703的敲除效果。
CRISPR/Cas9 技术是继“锌指核酸内切酶”（ZFN）和“类转录激活因子效应物核酸酶”（TALEN）后的第3代，最新的基因编辑技术，能通过guide-RNA 靶向定位产生DNA 双链切割，DNA 双链切割损伤可以通过非同源性末端相连修复（NHEJ）或同源修复（HDR）。NHEJ 的结果就是从基因组水平的基因敲除效果。HDR 的结果就是可以实现基因特定位点的精确编辑。虽然CRISPR/Cas9 技术更多是应用在基因编辑上，但是其应用在基因敲除上也比以往的基因敲除工具更具优势：该技术可以实现基因组水平的基因敲除，所以敲除效果更加稳定。现有的siRNA、shRNA 等基因敲除技术都是mRNA 水平的降低，所以不如CRISPR/Cas9技术的敲除效果稳定。
综上所述，本研究成功构建了plenti-Crisp V2ZNF703 sgRNA 重组质粒，并通过构建ZNF703敲除HCT-116 细胞系以及利用荧光定量PCR 验证。所构建plenti-Crisp V2ZNF703 sgRNA 可以有效地敲除ZNF703 基因，为进一步探索ZNF703 在肿瘤中的分子生物学功能打下了基础。
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