杨少滢，肖 成，刘 宇，吴 健，3，赵玉民，3，曹 阳*
（1.吉林省农业科学院，吉林 公主岭 136100；
2.延边大学，吉林 延吉 133002；
3.农业农村部肉牛遗传育种重点实验室，长春 130000）
随着我国居民生活水平的提高，市场对牛肉的需求量逐渐增加，高品质牛肉的需求更是无法得到满足。目前我国肉牛养殖业所提供的肉产品无法满足国内市场需求，而且本土肉牛品种的产肉性能及肉质不如国外优秀的肉牛品种，这导致我国需要从国外进口大量牛肉来弥补市场所需。为了解决这一棘手问题，科研工作者引进国外优质品种牛与本土品种杂交，通过分子育种和常规育种方法培育出具有我国自主知识产权的新品种。目前我国自主培育的肉牛品种很多，如沃金黑牛、草原红牛、延边黄牛等，这些新品种的产肉性能及肉质性状均有显著提升，但与国外优良品种仍有差距［1］。同时，国内培育的不同品种间生产性能和肉质性状也存在差异。因此，了解及探索调控肉牛经济性状的关键基因对于提高其选育强度至关重要。
胰岛素样生长因子1（Insulin-like growth factor-I，IGF1）可以通过与生长激素结合而对家畜机体生长进行调控［1］；
还可以影响肌肉、骨骼及脂肪的代谢合成，对生命体至关重要［2］。脂肪酸结合蛋白HFABP在肌肉中表达，对家畜生长具有重要作用［3］。生长激素（growth hormone，GH）是大脑垂体前叶分泌的一种多肽类激素，对于动物机体必不可少，能够调控其生长发育。生长激素受体（growth hormone reporter，GHR）是与生长激素结合而发挥作用的［4］。生肌调节因子5（myogenic factor 5，Myf5）参与肌肉生长发育，是调节肌肉合成、影响肉质的重要基因［5］。Leptin又称瘦素，中枢神经系统调节能量代谢进程中的重要能量调节因子，参与脂肪沉积的调节［6］。肌细胞生成素（myogenin，MyoG）是与产肉性状相关的重要候选基因，与家畜体重、胴体重具有显著相关性［7］。肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）主要在骨骼肌中表达，参与调控骨骼肌的生长发育［8］。脂蛋白分解酶（lipoprotein lipase，LPL）、长链脂酰辅酶A 合 成 酶1（long-chain fatty acyl-CoA 1，ACSL1）、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferative activated receptor gamma，PPARγ）等基因主要在脂肪组织中表达，并且是脂肪细胞形成与分化的标志基因［9-11］。
本试验希望通过比较不同品种牛间生长及肉质相关基因找到重要的分子表达机制，以提高分子育种强度、提升经济性状。
1.1 试验动物及样品的采集
草原红牛、沃金黑牛饲养及饲喂条件相同，均按照国家肉牛饲养标准（NY／T 815—2004）饲养。实验室前期已对草原红牛群体和沃金黑牛群体的生长数据、肉质数据进行对比。测量的数据有体重、体高、十字部高、体斜长、胸围、腹围、管围、眼肌面积、背膘厚、肉色、嫩度、加压失水率、离心失水率、滴水损失、蒸煮损失、熟肉率等。沃金黑牛在生长及肉质性状上优于草原红牛，此数据部分正在投稿中，部分已经发表［12］。因此，从吉林省农业科学院畜牧兽医研究所的草原红牛群体里随机选择18月龄健康雄性草原红牛3头，从长春市皓月集团的沃金黑牛群体里随机选择18月龄健康雄性沃金黑牛3头，检测不同品种牛各组织中可能出现的差异基因。试验动物在同一屠宰厂屠宰并采集其肝脏组织、皮下组织、背最长肌组织保存于液氮，用于提取RNA。
1.2 试验试剂及用品
TRIzol试剂，购自赛默飞生物有限公司；
异丙醇、氯仿，购自北京化工有限公司；
双蒸水，购自生工生物工程（上海）有限公司；
反转录试剂盒，购自TAKARA生物公司；
实时荧光定量仪器、试剂及配套的96孔板，均购自Roche生物有限公司；
引物，金唯智生物有限公司提供。
1.3 RNA提取及反转录
将冻存在液氮中的组织样品取黄豆粒大小进行液氮研磨，然后将研磨后的粉末转移到EP管中，加入1 mL TRIzol试剂，按照经典的RNA提取步骤进行试验。提取好的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳进行完整性验证，随后利用超微量分光光度计进行RNA纯度、浓度的检测。分光光度计显示的OD260／OD280值在1.8～2.1之间表示纯度较好。为了避免RNA降解，样品于-80℃超低温冰箱保存。总RNA进行反转录试验，反应体系：Mix 2μL，RNA 500 ng，ddH2O补到10μL；
反应程序：37℃预变性15 min，85℃变性5 s，12℃保存。反转录后产物加入90μL ddH2O后配成工作液，可直接用于定量试验或于-20℃冰箱保存。
1.4 引物设计及验证
以NCBI网站的牛IGF1、H-FABP、GH、GHR、Myf5、MyoG、MSTN、LPL、ACSL1、PPARγ、GAPDH基因组为参考，利用Primer Premier 5.0软件设计定量引物，引物信息见表1。以上述试验提取的cDNA为模板进行引物特异性验证。PCR反应体系：2×Taq Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上 下 游 引 物 各0.5μL，cDNA 1μL，总计为20μL。PCR反应程序：94℃预变性5 min；
94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；
72℃延伸8 min，产物于12℃保存。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
表1 定量引物序列Tab.1 Sequence of quantitative primers
1.5 定量试验
以沃金黑牛、草原红牛的肝脏、皮下脂肪、肌肉组织cDNA为样品进行实时荧光定量PCR试验。检测基因为IGF1、H-FABP、GH、GHR、Myf5、MyoG、MSTN、LPL、ACSL1、PPARγ，以GAPDH基因为内参基因进行比较。qPCR体系（20μL）：Light Cycler 480 SYBR GreenⅠMaster（2×）10μL，ddH2O 8μL，cDNA 1μL，上下游引物各0.5μL。反应程序：95℃5 min；
95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共40个循环；
95℃5 s，65℃1 min，40℃10 s，每组试验重复3次。采用Roche Lightcycler 480软件收集测定数据。
1.6 数据的统计分析
数据采用SPSS 17.0软件进行统计，以“平均值±标准差”表示。相同组织不同基因间表达差异采用t检验方法进行比较，P＜0.05表示差异显著。
2.1 引物特异性验证
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。由图1可以看出，PCR产物条带单一，可用于接下来的试验。
图1 各基因PCR产物电泳图谱Fig.1 PCR products of each gene
2.2 沃金黑牛、草原红牛生长性状相关基因相对表达量对比
IGF1、H-FABP、GH、GHR、Myf5、MSTN基因主要在肝脏及肌肉中表达，显著影响牛的生长性状，如体重、体高、十字部高、体斜长、胸围、腹围、管围，对上述基因在肝脏及肌肉中进行定量试验，结果见图2。由图2可以看出：沃金黑牛肝脏及肌肉中IGF1、H-FABP基因表达量均显著高于草原红牛（P＜0.05）；
GH、GHR基因表达量在草原红牛肝脏中较高，而沃金黑牛则是肌肉中较高（P＜0.05）；
两品种牛肝脏中没有检测到Myf5和MSTN基因，这两种基因在沃金黑牛肌肉中的表达量显著高于草原红牛（P＜0.05）。
图2 沃金黑牛、草原红牛肝脏、肌肉组织中生长性状相关基因相对表达量Fig.2 Relative expression levels of genes related to growth traits in liver and muscle tissues of Woking Black cattle and Steppes Red cattle
2.3 沃金黑牛、草原红牛肉质性状相关基因对比
IGF1、PPARγ、LPL、ACSL1基因主要在肝脏及脂肪中表达，显著影响牛的肉质性状，如眼肌面积、背膘厚、嫩度、熟肉率等，对上述基因在肝脏及脂肪中进行定量试验，结果见图3。由图3可以看出：IGF1基因表达量在沃金黑牛和草原红牛脂肪组织中无显著差异（P＞0.05），而沃金黑牛肝脏中IGF1基因表达量显著高于草原红牛（P＜0.05）；
PPARγ和LPL基因表达量在草原红牛肝脏中较高，而在沃金黑牛脂肪组织中较高（P＜0.05）；
ACSL1基因在两品种牛的肝脏组织中没有检测出来，脂肪组织中沃金黑牛组织显著高于草原红牛（P＜0.05）。
图3 沃金黑牛、草原红牛肝脏、脂肪组织中肉质性状相关基因相对表达量Fig.3 Relative expression levels of genes related to meat quality traits in liver and adipose tissue of Woking Black cattle and Steppe Red cattle
沃金黑牛和草原红牛都是我国近年来培育出的新品种，抗逆性强，耐粗饲，具有较好的生长性能及肉质性状。沃金黑牛是由黑毛牛为父本、延边牛为母本培育而成，而草原红牛是短角牛与蒙古牛杂交选育而成［13-14］。由于科研人员所处的时代背景及培育目的不同，导致沃金黑牛偏向肉用，而草原红牛更偏向于乳肉兼用。在相同月龄的两个品种牛中，沃金黑牛体型明显大于草原红牛。屠宰过程中，沃金黑牛的背最长肌横截面出现的大理石花纹显著高于草原红牛。品种导致这些性状出现明显差异，但从分子层面来说，可能是调控基因的表达不同导致性状出现了差别。本试验中，IGF1、H-FABP基因具有相同的表达规律，不管在肝脏还是肌肉组织中，沃金黑牛的表达量均最高。与之相反的是，GH、GHR、PPARγ和LPL基因在草原红牛肝脏组织中的表达量均高于沃金黑牛，而在肌肉以及脂肪组织中沃金黑牛的表达量更高。在肝脏组织中这些基因的作用不单单具有调节生长及肉质性状的功能，更多是能够行使其他生理作用［4］。而这些基因在能够发挥实际作用的组织中呈现出相反的表达，与实际测量的生产数据吻合。Myf5、MSTN、ACSL1基因也出现相似的结果。在发挥作用的组织中，沃金黑牛表达量更高。有趣的是，上述基因没有在肝脏组织中检测出来，可能是因为表达量较低。基因在动物发育的不同时间段其表达量可能存在较大差异。如果将试验样本扩大到6，12，24月龄可能会有更全面的表达谱，这将是课题组以后要探索的方向。
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