闫春梅，郑伟，韩叶，李忠强，肖治国，陈伟强，柳鹏
（吉林省水产科学研究院，长春 吉林 130033）
冷水性溯河产卵洄游大麻哈鱼（Oncorhynchus keta Walbaum），俗称太平洋鲑、大马哈鱼等[1]，曾在吉林省图们江流域广泛分布。近些年由于兴修水利等人为因素破坏了大麻鱼产卵洄游通道，影响自然繁殖，生殖洄游亲本数量锐减，野生资源衰退，目前已处于濒危状态[2]。图们江流域大麻哈鱼群体遗传多样性较丰富[3]，可以通过人工增殖放流的方式补充大麻哈鱼资源量。吉林省已开展大麻哈鱼增殖放流活动十余年，年放流数量达40～50 万尾。随之展开的大麻哈鱼放流效果评估研究也已经历了从挂牌标记[4]、剪鳍法[5]、荧光标记[6,7]到微卫星标记[8-10]、耳石标记[11,12]等多个阶段。剪鳍法和金属线标法甚至荧光标记法均对鱼体造成不同程度的伤害，且需逐尾操作，不适宜大规模标记。微卫星法对鱼体没有伤害，但操作门槛高，需要专业的分子生物学作为技术支撑，且耗资巨大，亦不适用于大规模标记。
耳石是硬骨鱼类内耳的钙质结晶，能准确记录生活史中经历的温度变化，阅读耳石轮纹的周期性、明暗度、宽窄度等信息即可推断鱼类生活的历史水温变化[13]。耳石温控标记法即通过短期调控环境水温，改变耳石上的日轮形成方式，形成终身不变的标记，为评估大麻哈鱼人工增殖放流效果提供技术支持。目前，耳石温控标记法已在红点鲑（Salvelinus namaycush）[14]、太平洋鲑（Oncorhynchus spp）[15]、胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）[16]、大西洋鳕（Gadus morhua）[17]上获得了成功经验。本研究采用改变孵化期水温的方式标记大麻哈鱼耳石，根据不同的日轮图谱确定其来源。
1.1 大麻哈鱼发眼卵
试验用大麻哈鱼发眼卵由吉林省延吉市青龙渔业有限公司从图们江流域大麻哈鱼生殖洄游群体经人工繁殖所得。受精卵流水孵化，水温8～10℃，发育至发眼期后经干法运输至吉林省水产科学研究院继续全程流水控温孵化。
1.2 标记图谱
本研究按照摩斯密码规则设计两组标记图谱：CHN 和JL。摩斯密码规定字母C 密码为“嗒嘀嗒嘀”；
H 为“嘀嘀嘀嘀”；
N 为“嗒嘀”；
J 为“嘀嗒嗒嗒”；
L 为“嘀嗒嘀嘀”。嘀为1 个单位时长，嗒为3 个单位时长[18]。受大麻哈鱼发育时长限制，本研究将嗒设为2 个单位时长，以缩短标记天数。以24 h 为1 个单位时长。以字母C 为例，嗒为2 个单位时长即48 h 高温，嗒嘀之间为字母内间隔24 h 低温，嘀为1 个单位时长即24 h 高温。因此，字母C 表示为48H-24C-24H-24C-48H-24C-24H 模式。字母C 和字母H 之间为字母间间隔低温24 h，即24C。
试验分4 组：1 组为恒温组，全程（11±0.5）℃流水孵化；
2 组为CHN 组，按照摩斯密码规则，标记图谱为48H-24C-24H-24C-48H-24C-24H-24C-24 H-24C-24H-24C-24H-24C-24H-24C-48H-24C-2 4H；
3 组为JL 组，按照摩斯密码规则，标记图谱为24H-24C-48H-24C-48H-24C-48H-24C-24H-24C-48H-24C-24H-24C-24H；
4 组为48 h 变温组，标记图谱为48H-48C-48H-48C-48H-48C-48H。各组标记模式图见图1。以高温标记字母，低温标记间隔的原则进行。其中白色区域代表高温区，间隔线代表低温区。线条及白色区域的宽度代表持续时间。
图1 耳石温控标记各试验组温控方式模式图Fig.1 Model diagram of temperature control mode in each test group
1.3 标记试验
试验选取大麻哈鱼发眼期受精卵干法运至实验室后，分为4 组，1 000 粒/组。1 组为恒温对照组；
2 组为CHN 标记组；
3 组为JL 标记组；
4 组为48 h 变温组。在控温在（11±0.5）℃的水族箱中暂养2 d 后，4 组均调温至（8±0.5）℃，作为标记图谱起始标记。24 h 后，4 组均调温至（11±0.5）℃，按照各组标记图谱开始温控标记试验。为减少受精卵受温度变化影响，高低温转换需在1～2 h 内温和过渡。每天记录受精卵死亡情况，挑出死卵。各组标记结束后均转换至（8±0.5）℃，持续24 h，作为标记图谱结束标志。
1.4 标记效果鉴定
各组标记结束后，记录各组死亡率，随机取初孵仔鱼样品20 尾/组，置于95%乙醇中固定，鉴定标记效果。
1.4.1 耳石摘取
从95%乙醇中取出初孵仔鱼，剪下头部置于载玻片中央，用蒸馏水清洗3 次后，滴加6.5%次氯酸钠溶液至浸没整个鱼头。在解剖镜下观察浸蚀效果，待整个鱼头组织仅剩眼部及周围少量组织后，小心将剩余组织移除，解剖镜下观察，将剩余液体中的耳石小心移至载玻片干净部位，蒸馏水清洗耳石3 次，每次用滤纸吸净周围液体。室温晾干。
1.4.2 耳石制片
载玻片干燥后，在耳石旁边滴加1 滴中性树胶，然后在中性树胶上滴加二甲苯，使中性树胶扩散至耳石区域，包埋住耳石而封片，室温晾干后，Olympus BH-2 光学显微镜观察耳石轮纹。
1.4.3 标记图谱分析
按照设定的标记图谱，人工调节水温形成特殊的耳石标记日轮。温控试验前以24 h 低温标记轮作为标记图谱起始信号，标记结束后以24 h 低温标记轮作为标记图谱结束信号。绘制标记条形码用于建立标记档案。以样品中耳石出现标记图谱的仔鱼数量占取样总数的百分比计算标记率。以标记中死亡胚胎数量占起始样品总数的百分比计算死亡率。
2.1 耳石标记图谱鉴定
大麻哈鱼耳石原基及中心核区形成于发眼期[19]，因此本研究在大麻哈鱼发眼期后进行耳石温控标记。根据国际通用摩斯密码规则设计可辨识率高的标记图谱，按照各组标记图谱（图1）实施温控标记。结果显示，4 组耳石样本标记率达到100%。各组耳石中心核区均出现的第1 条暗带，为大麻哈鱼发眼卵由养殖场运输至控温实验室过程中形成的标记轮。第2 条暗带为控温试验开始前各组均调整水温至（8±0.5）℃，形成的标记图谱起始标记。之后各组轮纹均按照各组预先设计的标记图谱实施控温标记，各组标记轮纹与设计图谱一致。CHN 组和JL组标记轮纹中，以白色区域代表标记图谱形成模式，白色区域的宽度代表持续时间的长短。暗色轮纹仅作为分隔（图2）。
图2 耳石温控标记图谱Fig.2 Maps of otolith thermal marking
2.2 标记率及死亡率
各组标记结束后，记录各组标记率及死亡率（表1）。由表1 表可知，除恒温对照组外，各组所采样品均检测到与预期相符标记图谱，标记率100%。除CHN 组死亡率略高于恒温对照组外，其他标记组死亡率均低于恒温组，各组差异不显著（P＞0.05）。
表1 温控标记各组标记率及死亡率情况表Tab.1 Marking rates and mortality in each group
3.1 耳石标记时间
鱼类耳石第一日轮的形成存在种间差异，如底鳉（Fundulus heteroclitus）的第一日轮形成于刚孵出时[20]；
鲱（Clupea harengus pallasi）第一日轮形成于卵黄囊完全吸收后[21]；
欧洲鳀（Engraulis encrasicolus）第一日轮形成于孵出第2 d[22]，而大麻哈鱼耳石第一日轮则形成于发眼期[19]。因此，本研究选择在大麻哈鱼受精卵进入发眼期后开始实施标记。
3.2 耳石制片
鱼类耳石通常有三种制片方式：剖片、压片和磨片，其中，剖片和压片适用于发眼期至破膜阶段的胚胎期，磨片则适用于稚鱼至成鱼阶段的大规格鱼类。本研究在大麻哈鱼发眼卵至破膜阶段进行温控标记，不需要用磨片。压片方式未摘出耳石，而是用盖玻片直接将整个胚体压制成片，耳石外有组织覆盖，镜下观测耳石轮纹清晰度不够。经试验验证，最终选择剖片方式进行耳石制片。
剖片是在解剖镜下利用解剖工具摘取耳石。经过多次试验验证，破膜期鱼体规格小，耳石仅有0.25 mm×0.35 mm[23]，解剖镜下摘取耳石难度很大,且存在标本不洁净等问题。本研究使用次氯酸钠这种腐蚀性溶液，将耳石周围组织腐蚀掉，使耳石的摘取变得容易，且耳石干净，镜下观察耳石轮纹清晰，利于标本的长期保存。
3.3 标记效果
大麻哈鱼耳石标记图谱主要用于区分放流大麻哈鱼的不同属地。要求标记图谱具有独一无二及高度可辨识特征。本研究将国际通用摩斯密码规则融入大麻哈鱼耳石标记图谱的设定，主要因为摩斯密码编码简单清晰，二义性小，编码主要是由两个字符表示：“.”和“—”，一短一长，通常也称为“嘀”、“嗒”。通过不同的排列顺序来表达不同的英文字母、数字和标点符号。
本研究设立CHN 和JL 两组字母组合作为标记图谱。大麻哈鱼耳石标记最佳标记时间在发眼期至破膜期之间，受精卵破膜之后活动范围变大，摄食活动等会不同程度地影响标记图谱，使标记难度增加。因此，本研究将标记天数控制在20 d 左右。同时考虑到标记图谱的清晰性，将短标记“嘀”设为24 h，长标记“嗒”设为48 h，使长标记和短标记区分更加明显。CHN 组标记整个标记期用时22 d，JL 组标记用时19 d。将摩斯密码规则应用于耳石标记，保证了标记的清晰性、准确性及高度可辨识性。
为了验证耳石温控标记法是否影响大麻哈鱼孵化率，本研究以恒温对照组作为参照，标记过程中每天记录各组卵粒死亡情况。标记结束后，统计各组受精卵死亡情况。恒温对照组标记受精卵共死亡36 粒，死亡率3.6%，CHN 组死亡率稍高于对照组，共死亡38 粒，死亡率3.8%，JL 组和48 h 恒温对照组死亡率均小于恒温对照组，分别为3.0%和3.1%。组间差异不明显。可见，耳石温控标记法不会对大麻哈鱼卵孵化率造成不良影响。同时，检测CHN 组、JL 组和48 h 恒温对照组所有采集样本的耳石轮纹。结果显示，除恒温对照组外，其他三组所有采集的耳石样本均出现与各组预设标记图谱相一致的清晰轮纹，各组标记率均达100%。
3.4 耳石温控标记的应用
耳石终生生长，具有代谢惰性，一旦沉积，耳石材料不可能被重吸收或者改变。因此，可以从鱼类耳石入手，利用鱼类耳石能准确记录生活史中的经历事件，如温度波动、摄食及饥饿、光周期等特点，人为短期地对水温进行调控以改变耳石上的一个或多个生长轮纹的特征，形成终身可识别的标记。再通过阅读耳石轮纹生成的周期性、宽度及光密度等信息识别放流群体。本文仅仅通过人工调控温度波动就能对胚胎、仔鱼耳石进行有效地大规模标记，方法简单，费用低廉，可以满足对大麻哈鱼放流进行长期跟踪评估的技术要求。
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