巩玉辉，陈翠翠，郭 明，方 晔**，张 军**，骆 衡，李 娇
（1.贵州金蟾大山生物科技有限责任公司，贵州 毕节 553300；
2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550014）
红托竹荪（Dictyophora rubrovolvata M.Zang，et al.）隶属于担子菌门（Basidiomycota）蘑菇纲（A－garicomycetes）鬼笔亚纲（Phallomycetidae）鬼笔目（Phallales）鬼笔科（Phallaceae），主要分布在我国西南地区[1-3]。其子实体洁白、细嫩爽口，含有大量的氨基酸、蛋白质、维生素等营养物质，具有抗肿瘤、治疗慢性气管炎、降血压、降胆固醇等多种药用功能，素有“真菌之花”和“山珍”的美称[3-7]。红托竹荪作为贵州省的特色珍稀食用菌，理应迅速发展成为贵州地区最具市场潜力和竞争力的品种。但由于红托竹荪栽培周期长，栽培过程中常发生病虫害而严重影响其产量和品质，其中腐烂病是最严重的病害之一，因此栽培成功的关键就是腐烂病的防治[1，8-9]。
腐烂病病害常发生在红托竹荪菌蛋形成时期，一旦感染，整个栽培大棚均出现菌蛋烂皮至腐烂的现象，严重影响产量[10]。贵州大学田风华团队[11]通过研究发现，红托竹荪腐烂病是一种真菌性病害，主要由鬼笔复膜孢酵母菌（Saccharomycopsis phalli FH Tian，XX Yuan & KQ Peng）引起。初期症状为子实体表面分泌淡红色小液滴，多发生在菌蛋交界处和近土侧。随后液滴逐渐变大，颜色加深，菌蛋渗出液滴处开始变红，整体呈黄水状，并由发病中心向外蔓延致使菌蛋全部溃烂。随着病害的发生，液滴表面聚集大量的跳虫，跳虫通过吸食菌蛋分泌物将病原菌携带至邻近的菌蛋上，从而扩大感染范围，并迅速传播至整个菇床乃至菇棚。在此过程中常伴随各种细菌、真菌、黏菌、线虫、昆虫、螨虫等的滋生，引起二次腐生性病害的发生。发病部位表面呈现绿霉病症状，迅速蔓延至整个菇棚，导致菌蛋不能正常生长撒裙。该病害普遍发生于贵州省红托竹荪主产区，其中，连作大棚或者连作林区受害最严重，一般可使竹荪减产50%左右，严重的可减产80%以上甚至绝收[10]。该病的发生具有蔓延快、致病性强、防控困难等特点，是限制红托竹荪产业发展的主要因素，一旦发生将造成极大的经济损失[12]。
鬼笔复膜孢酵母菌引起菌棒和子实体腐烂的情况详见图1。
图1 鬼笔复膜孢酵母菌引起菌棒和子实体腐烂Fig.1 Rot of artificial bed-logs and fruit bodies caused by the Saccharomycopsis phalli
由图1可看出，菌棒腐烂常发生在原基形成前，通常是菌棒覆土待菌丝长至土层表面时出现大面积菌棒腐烂，随后滋生大量跳虫、菇蚊、菇蝇，加快病害传播；
后期病害表现为菌蕾腐烂和虫害大量爆发。在栽培过程中发现，烂棒和菌蕾腐烂常出现在同一批菌棒的不同阶段。因烂棒后会吸引害虫，造成虫害滋生，因此防治更加困难。而子实体腐烂则发生在原基形成后子实体生长的过程中，此时使用化学药物防治容易造成农残超标。因此，寻求一种安全又高效的病害防治措施迫在眉睫。
通过鬼笔复膜孢酵母菌对菌棒和菌丝体的侵染试验，药物、高温对致病菌的抑制试验、不同pH条件下致病菌的生长试验，研究鬼复膜孢酵母菌在不同温度下的致病力、适宜其生长的pH范围、高温耐受范围以及最佳抑菌药物，从而为腐烂病防治提供试验数据和理论支撑。
1.1 供试病原菌
菌株：野生型强致病力的菌株（保藏号GUCC 2006），由贵州大学提供，保存于中国贵州大学农学院植物病理学菌种保藏中心，其菌落特征如图2所示。
图2 鬼笔复膜孢酵母病原菌Fig.2 Saccharomycopsis phalli pathogen
如图2所示，病原菌菌落淡黄色，显微镜下细胞呈卵圆形，顶端分裂出芽孢。
病原菌固体培养基配方：葡萄糖20 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、琼脂18 g，水1 000 mL。
病原菌液体培养基配方：葡萄糖20 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g，水1 000 mL。
1.2 供试药剂
试验共选取12种杀菌药，研究药物对致病菌的抑制作用，各杀菌药的有效成分及使用时的稀释倍数详见表1。
表1 不同杀菌药及生产厂家Tab.1 Different fungicides and manufacturers
1.3 试验方法
1.3.1 病原菌培养
将病原菌从冰箱取出后恢复至适温，并用接种环划线法接种到固体培养基上，于温度为28℃下黑暗培养72 h。待菌落萌发后将其接种到液体培养基中，于温度为28℃、转速为150 r·min-1的条件下培养72 h，制作成液体病原菌。
1.3.2 病原菌侵染菌丝体试验
将1.3.1中培养好的液体病原菌接种到菌丝健壮的红托竹荪平皿上，接种点为菌丝尖端生长处。将完成接种的平皿分别置于10℃、15℃、20℃、25℃、28℃条件下培养，每隔24小时记录1次菌丝生长情况以及病害程度，每个处理设置5个重复。
1.3.3 病原菌侵染菌棒试验
用无菌滤纸吸附1.3.1中培养好的病原菌发酵液，将其贴到菌棒上进行菌丝侵染试验，以吸附无菌液体培养基的滤纸为对照，进行相同的处理。在25℃条件下培养，每隔24小时观察1次并记录菌棒受侵害程度，每组设置5个重复。
1.3.4 不同药物的抑菌试验
采用抑菌圈法测定各供试药剂的抑菌效果[13]。将定量的固体培养基（pH自然）冷却至48℃左右后倒入培养皿，待凝固后制成平板备用。取100 μL病原菌培养液滴入平板，用玻璃棒在平板培养基上均匀涂布。用灭菌蒸馏水将供试药剂配制成对应浓度，用经过消毒的镊子夹取滤纸片（直径为6 mm，已灭菌），分别浸在配制好的药液中，1 min后取出放在灭菌烘干的滤纸片上停留2 min，然后放在涂有病原菌的培养皿中。每皿4张滤纸片，每种药物重复4个平皿，即重复16次，以无菌水为对照。处理完成之后，将培养皿倒置于28℃恒温箱中培养。
培养期间定时观察致病菌生长情况，72 h时取出，测量抑菌圈直径。采用新复极差法对试验数据进行统计分析，确定各药剂的差异显著性。
1.3.5 不同药剂对红托竹荪菌丝生长的影响试验
1）培养基的制作
基础培养基配方：土豆100 g（水煮过滤）、葡萄糖5 g、果糖25 g、蛋白胨5 g、硫酸铵2.5 g、杂木屑70 g（粒径100目）、琼脂粉18 g，水1 000 mL[13-14]。
含杀菌药的培养基：在无菌条件下，将一定量的药液加入至冷却到48℃左右的基础培养基中，混匀后倒入培养皿中制成平板[13]。
2）菌丝体培养
在超净工作台接种，用打孔器（直径5 mm）在母种平板接种块周围2 cm～3 cm区域打孔，将菌种块接种于平板培养基中央[10]。后将培养皿置于23℃条件下恒温培养，定期观察菌丝的生长速度、生长状态、均匀度等。
3）菌丝生长速度统计
接种后定期观察菌丝的生长情况，并采用“十”字交叉法测定菌落直径，以平均值代表菌落大小。以第7天的菌落直径为依据计算菌丝生长速度，菌丝生长速度（V，mm·d-1）的计算公式为：
式中：D1为“十”字交叉法测量的第1个菌落直径（mm）；
D2为“十”字交叉法测量的第2个菌落直径（mm）；
d2为测量时的天数（d）；
d1为初始天数（d）。
1.3.6 高温对病原菌的影响试验
将培养好的液体病原菌分别静置于40℃、45℃、50℃、55℃条件下，每隔1小时取100 μL样品涂布于培养皿中，于28℃条件下培养72 h，统计菌落数量，每个温度处理做3次重复。
1.3.7 不同pH对病原菌的影响试验
液体培养基灭菌并冷却后，使用HCl（浓度为0.1 mol·L-1）和NaOH（含量为1%）溶液调节pH为2.40、3.39、4.55、5.57、6.72、7.85、8.47、9.60、10.72、11.71共10个梯度。然后接入病原菌，于28℃、135 r·min-1条件下培养72 h，每个处理设置3个重复。培养结束后将培养基摇匀，使用移液枪分别取1 mL培养液，并将其稀释10 000倍，取100 μL培养液涂布于培养皿中，于28℃条件下培养72 h，统计菌落数量。
1.4 统计学处理
采用SPSS 23.0软件进行单因素方差和线性相关分析。
2.1 病原菌侵染菌丝结果统计
不同温度下病原菌侵染红托竹荪菌丝的结果详见图3。
图3 不同温度下病原菌侵染菌丝的时间Fig.3 Time of pathogen infected hyphae at different temperatures
如图3所示，随着温度的升高病原菌对竹荪菌丝的侵染时间缩短。在10℃条件下，病原菌以及红托竹荪菌丝生长都比较慢，腐烂病病原菌活力很弱，对菌丝生长不造成伤害，无致病性；
15℃条件下，培养至第15天红托竹荪菌丝开始出现病症，菌丝发黄，吐黄水；
20℃条件下培养至第12天，25℃条件下培养至第11天，30℃条件下培养至第10天红托竹荪菌丝均出现病症。说明培养温度与病症出现时间呈负相关。
不同温度下病原菌侵染红托竹荪后，病斑出现时间及病斑大小情况详见图4和表2。
表2 不同处理组间病原菌的病斑大小Tab.2 Lesion size of pathogenic bacteria in different treatment groups
如表2和图4所示，随着温度的升高，病原菌对菌丝的伤害程度逐渐加大，具体表现在发病时间早，且病斑直径大。可见高温有利于病原菌的生长和扩散。
图4 不同处理组病斑大小Fig.4 Lesion size between different treatment groups
2.2 病原菌侵染菌棒结果统计
按照1.3.2中的方法用病原菌侵染菌棒，结果详见表3。
如表3所示，温度为10℃时病原菌不会侵害菌棒，未造成菌棒腐烂；
在15℃条件下，菌棒培养至第21天出现轻微病斑；
在20℃条件下，菌棒培养至第17天开始出现轻微病斑，至第24天菌棒完全腐烂；
在25℃与30℃培养条件下，菌棒在第11天就出现病斑，至第20天菌棒完全腐烂。说明随着温度升高，病原菌对菌棒的致病作用逐渐增强，能快速侵染菌棒造成菌丝死亡。此时将菌棒菌丝体回接到无菌营养平皿中无法恢复生长。试验中菌棒的情况与连作大棚中栽培菌棒腐烂时间（16 d～20 d）基本一致。
表3 不同处理组菌棒腐烂程度Tab.3 The rot degree of artificial bed-logs between different treatment groups
通过上述试验可知，在温度超过20℃时，鬼笔复膜孢酵母能够有效侵染红托竹荪菌丝体；
在温度为20℃～30℃时，经过16 d～20 d菌棒完全腐烂，严重影响红托竹荪的产量。
2.3 药剂对病原菌的抑菌作用
按照1.3.4的试验方法测定杀菌药对病原菌的抑菌作用，48 h后统计结果，详见图5和表4。
表4 药剂对病原菌的抑菌作用Tab.4 Bacteriostatic effect of medicament on pathogenic bacteria
由图5、表4可知，丙环唑对病原菌具有明显的抑制作用，与其他药剂相比差异显著；
其次是吡唑醚菌酯、苯甲嘧菌酯、咪鲜胺，抑菌圈直径分别为13.06 mm、11.38 mm、12.00 mm，但3种药剂的抑制作用差异不显著；
随后是唑醚咪鲜胺、苯醚甲环唑、氟菌·肟菌酯；
再次是嘧菌酯、肟菌·戊唑醇；
其中氟菌·霜霉威、溴菌腈、霜脲嘧菌酯抑菌圈最小，几乎无抑制作用。
图5 药剂对病原菌的抑菌圈大小Fig.5 Size of bacteriostatic circle of medicament on pathogenic bacteria
2.4 药剂对红托竹荪菌丝的影响结果
按照1.3.6的试验方法测定药剂对红托竹荪菌丝的影响，持效期是在一定时间后重新接种后进行测定，具体结果详见表5。
从表5可以看出有8种药物对红托竹荪菌丝具有比较大的影响，唑醚咪鲜胺、吡唑醚菌酯、肟菌·戊唑醇、丙环唑持效期大于30 d，即重新接种后培养30 d菌丝依然不萌发；
咪鲜胺、溴菌腈、苯甲嘧菌酯、苯醚甲环唑刚开始接种不萌发，重新接种后菌种块萌发，持效期在15 d以上；
含有氟菌·霜霉威、氟菌·肟菌酯、霜脲嘧菌酯、嘧菌酯的培养基中的菌种块可以萌发，但与对照组相比，生长速度明显慢且差异显著，菌丝的生长均匀程度也比对照组差。
表5 药剂对红托竹荪生长的影响Tab.5 Effect of medicament on mycelial growth of Dictyophora rubrovolvata
2.5 高温对病原菌的影响
高温对病原菌菌落数量的影响情况详见表6。
通过表6可知，病原菌在40℃条件下培养1 h～13 h依然存活，同时菌落数量和菌落大小与处理时间呈负相关，即处理时间越长，菌落数量越少、菌落越小；
病原菌在45℃条件下培养4 h生物活性还很强，培养5 h～6 h时极少存活，8 h之后完全失活；
病原菌在50℃条件下培养2 h后生物活性还很强，培养3 h时极少存活，4 h之后完全失活；
病原菌在55℃条件下培养1 h后生物活性还很强，培养2 h时极少存活，3 h之后则完全失活。
表6 不同处理组病原菌的菌落数Tab.6 Colonies number of pathogens in different treatment groups
2.6 不同pH对病原菌生长的影响
每个pH处理组设置3个重复，培养液稀释10 000倍后，病原菌菌落数量统计情况详见表7和图6。
表7 不同pH下病原菌菌的落情况Tab.7 Colony condition of pathogen under different pH
图6 不同pH下病原菌菌落数量Fig.6 Colonies number of pathogen under different pH
通过表7和图6可知，pH在4.55～7.85之间时，病原菌菌落数量较多，pH在9.6以上时病原菌不生长，在pH较低的条件下病原菌生长会减缓，说明过酸或者过碱的环境都会抑制病原菌的生长。
腐烂病是红托竹荪栽培中常见的一种灾难性病害，一旦发生，患病组织将迅速被大量腐生微生物定殖，并通过昆虫等大量传播病害。因此腐烂病的防治一直是红托竹荪栽培过程中的重点。通过本次试验得出结论：1）鬼笔复膜孢酵母菌随着温度的升高对红托竹荪的菌丝侵害作用加强，因此高温是红托竹荪栽培过程中腐烂病发生的诱因。如果菌丝、菌蛋等长时间处于高温条件下，将引起菌蛋表层免疫力低下，从而发生病害。在10℃～15℃条件下鬼笔复膜孢酵母菌的活力不强，致病力弱；
在20℃～30℃条件下，平板中的菌丝10 d～12 d可发生病害，菌棒菌丝经过16 d～20 d会完全腐烂，从而引发严重的病害和虫害，严重影响后期的产量。2）鬼笔复膜孢酵母菌生长的适宜pH为4～8，该条件下病原菌生物活性强、繁殖快，高pH环境可使病原菌失活，能有效减少其传播。因此在红托竹荪栽培前期，一定要做好环境消毒，对于发生腐烂病的区域可通过提高pH来减缓病害的传播。3）对于鬼笔复膜孢酵母菌而言，环境温度低于45℃并不能达到杀菌的效果。因此在红托竹荪栽培过程中，可根据实际情况采用巴氏杀菌、高温蒸汽杀菌的方式，使环境温度达到55℃并保持2 h以上，均可完成对病原微生物的消杀。4）通过药剂的筛选可以看出，丙环唑对鬼笔复膜孢酵母菌具有很好的抑制作用，但其对菌丝的伤害程度也较大，因此不能在红托竹荪菌丝体阶段直接使用。栽培者可以在不同阶段对土壤、环境、覆盖物等用该药物进行消毒。
对于红托竹荪腐烂病，要以物理防治为主，化学防治为辅。主要措施包括：1）保持栽培设施、场地等的卫生，避免连作。对栽培原料、土壤要合理消毒。在栽培中可以采用焖棚、高温蒸汽等措施对栽培场所进行消毒，预防病原菌的产生。2）栽培季节的合理规划、栽培温度的控制，无论是常规大棚栽培还是工厂化栽培都至关重要。在菌丝生长至土层期间，环境温度不可过高，这样既可以避开病原菌的最适生长温度，同时偏低的温度使红托竹荪菌丝生长健壮，有利于其子实体的形成。3）高pH对病原菌具有致死作用，对于产生病害的区域可以覆盖石灰等强碱物质阻断病原菌的传播，以减少病害的发生。4）该病原菌在10℃～15℃条件下生长缓慢，因此栽培时一旦发现病害，要进行通风、降温，减少空气湿度，以便抑制病原菌的生长和传播。5）丙环唑对于该病原菌的生长具有强抑制作用，但是浓度高时会抑制菌丝生长，因此在不同栽培阶段可以配合着物理措施，用降低浓度的丙环唑溶液对栽培环境进行消杀，这对病害的传播也具有抑制作用。
猜你喜欢竹荪菌棒菌丝竹荪的深加工及营养成分功能性研究进展农产品加工(2022年6期)2022-11-18羊肚菌母种培养基配方的优化研究陕西农业科学(2022年2期)2022-03-28香菇出菇期菌棒补水技术要点新农业(2021年12期)2021-11-29中国被毛孢三种菌丝形态的超显微特征观察浙江农业学报(2021年5期)2021-05-31夏季高温期香菇菌棒间歇养菌三步走食用菌(2020年2期)2020-12-22陇西县香菇出菇管理规程农业科技与信息(2020年1期)2020-12-18菌中皇后话竹荪保健医苑(2018年8期)2019-01-11“竹君”食疗菜食品与生活(2018年6期)2018-10-08香菇注水时间怎样掌握今日农业(2018年5期)2018-03-24蛹虫草菌丝液体培养条件研究新农业(2017年15期)2017-09-11
