周郑雄，冯 豪，丁继林，王源哲，李章海，齐永波*
（1贵州省烟草公司遵义市公司，贵州 遵义 563000；
2安徽农业大学资源与环境学院，安徽 合肥 230036；
3中国科学技术大学烟草与健康研究中心，安徽 合肥 230052）
【研究意义】烟草作为一种重要的经济作物，在农业生产中占有重要地位，烟草种植已成为增加烟区农民收入和财政税收的重要来源。近年来，由于长期不合理施用化肥及不当耕作等原因，造成植烟土壤结构变差，肥力下降，土传病虫害问题日趋严重，选择适宜的优质高效肥料是保育和修复植烟土壤和实现优质烤烟生产的重要举措之一（牛桂言等，2017；
穆青等，2018）。根际是植物—土壤—微生物相互作用的关键微域，其物理、化学和生物学特性对施肥的响应最直接、最强烈，因而普遍受到重视（张福锁和曹一平，1992）。根际土壤团聚体稳定性和酶活性常被用来评价施肥对土壤质量的影响（武雪萍等，2005；
Caravaca et al.，2006；
史普酉等，2020）。因此，研究植烟根际土壤团聚体稳定性和酶活性对施肥的响应特征，对新型烟草专用肥的研发与应用具有重要的指导意义。【前人研究进展】当前新型烟草专用肥料的发展重点主要包括两个方向：一是通过改变肥料配方和肥料生产工艺，使其更加符合烟草生长的养分需求，进而提高肥料利用率；
二是通过肥料复配外源功能物质（如有益微生物），以兼顾养分供应、培肥改土及病虫害防控（赵秉强等，2004；
王成己等，2021）。大量研究表明，施用有机肥及有机无机肥配施较单施化肥对植烟土壤有明显改良作用，主要表现在调控土壤物理结构、养分状况及微生物特性，改善土壤根际微生态，通过促进烟草根系生长、养分吸收和增强抗病性，进而提高烤烟产量和品质（Chen et al.，2020；
余小芬等，2020；
马宜林等，2021）。Zou等（2018）和Chen等（2020）研究指出，对比烟草单作和仅施化肥，轮作和施用有机肥处理明显增加植烟土壤中＞0.25 mm粒级水稳性团聚体的比例和几何平均直径，并可促进土壤有机碳和全氮的累积，具有协同改善土壤结构和增加土壤肥力的作用。余小芬等（2020）研究发现，菜籽油枯有机无机复混肥可促进烟株根系和地上部生长发育，有利于烟株对氮磷钾养分的吸收利用，可提高烟叶产量和产值，改善烟叶化学成分协调性。马宜林等（2021）研究发现，羊粪有机肥与化肥配施能显著提高土壤蔗糖酶、蛋白酶和脲酶活性，增加土壤速效养分供应，有利于烟株根系发育和地上部分的生长。此外，生防菌与有机肥配合施用比单施生防菌能更有效防治烟草土传病害（Liu et al.，2013；
Yuan et al.，2016）。由此可见，复合微生物肥集无机肥的高效性、有机肥的长效性和微生物独特的生理调节功能于一体，将无机肥、有机肥和微生物菌剂三者的优缺点进行互补，可用作烟草绿色种植的多功能肥料（李鸣雷等，2008；
邵丽等，2012）。与常规肥料相比，复合微生物肥更宜于近根施用，从而进一步发挥功能微生物的增效作用和稳定性，有利于提高根际效应对根际微生态环境和植物生长发育的作用强度。根际土壤结构作为根际微生态环境的重要组成部分，对施肥引起的根际效应有明显响应，土壤结构是土壤功能的基础，良好的土壤结构能有效协调水肥气热；
土壤团聚体是土壤结构的基本单元，其组成和稳定性对土壤肥力和植物生长有重要影响（张福锁和曹一平，1992；
周虎等，2009；
Li et al.，2020）。此外，根际土壤酶活性对施肥引起的根际效应具有敏感响应，其活性强弱是表征土壤熟化和肥力水平高低的重要指标（邵丽等，2012）。【本研究切入点】前人针对烟草功能肥料或功能微生物的研究多集中于单施和当季施用效果，而针对二者复配后连续施用效应关注相对较少。本项目组前期研发了有机无机复混肥生产工艺（佘文凯等，2019），并筛选出烟草促生菌和烟草青枯病、黑胫病拮抗菌的混合菌剂（唐兴贵等，2020；
张欣悦等，2020），有必要进一步在连作条件下，将有机肥或有机无机复合肥与外源功能微生物配伍，研制针对特定作物的专用复合微生物肥，并围绕根际土壤性质变化进行适宜性评价。【拟解决的关键问题】利用本项目组研发的有机无机复混肥生产工艺（佘文凯等，2019），将前期针对烟草促生及土传病害防控研究筛选的微生物菌剂作为外源功能物质（唐兴贵等，2020；
张欣悦等，2020），与无机复合肥、有机肥复配成复合微生物肥，通过微区试验研究复合微生物肥施用对植烟根际土壤团聚体稳定性及关键土壤酶活性的影响，以期为优质烤烟复合微生物肥的研制与农田应用提供科学依据。
1.1 试验材料
供试无机复合肥（N∶P2O5∶K2O=10∶10∶25）、有机肥（N∶P2O5∶K2O=4.1∶6.8∶3.0）由贵州省遵义市烟草公司提供；
微生物菌剂为本项目组筛选的烟草促生菌和烟草青枯病、黑胫病拮抗菌的混合菌剂（唐兴贵等，2020；
张欣悦等，2020）；
复合微生物肥由无机复合肥、有机肥和微生物菌剂复配而成。供试作物为白菜和烟草，品种分别为上海青和云烟87。供试土壤为黄褐土，基本理化性质：pH 7.54，有机质10.26 g/kg，碱解氮40.69 mg/kg，有效磷15.65 mg/kg，速效钾234.0 mg/kg。
1.2 试验方法
试验于2020年3月—2021年8月依托中国科学技术大学烟草与健康研究中心进行。试验设4个处理，分别为空白对照（CK）、无机复合肥（CF）、有机肥+微生物菌剂（OF）和复合微生物肥（MF），每处理设3个重复并按照完全随机区组排列。小区面积为2.13 m×1.26 m，所有处理在等量氮、磷、钾养分基础上进行，施用量分别为N 105 kg/ha、P2O5105 kg/ha、K2O 262.5 kg/ha，有机肥不足的部分由化肥提供，全部用作基肥施用。种植制度为白菜—烟草轮作，其中10月—次年1月种植白菜，3—8月种植烟草。
1.3 样品采集及测定方法
分别在白菜、烟草收获期采集作物根系附近0～20 cm土层土壤，剔除土壤样品中石块和植物残根等杂物，混匀后取500 g土样装袋，带回室内置于4 ℃冰箱冷藏保存备用。
采用湿筛法进行土壤水稳性团聚体组成测定，称取50 g风干土样置于TTF-100型土壤团聚体分析仪（浙江省上虞市舜龙实验器厂）套筛顶部（套筛孔径自上而下依次为5、2、1、0.5、0.25 mm），先用水缓慢湿润10 min后，以上下振动频率40次/min、振幅4 cm，竖直振荡20 min。振荡结束后收集各级筛层团聚体并分别转移至铝盒中，60 ℃烘干至恒重，计算各粒级团聚体的质量分数。平均质量直径（MWD）和几何平均直径（GMD）是反映团聚体大小分布、评价团聚体稳定性的重要指标，计算公式如下（白怡婧等，2021）：
式中，Xi为任一级别范围内团聚体的平均直径（mm）；
Wi为对应于Xi的团聚体百分含量。
土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性测定分别按照苏州科铭生物技术有限公司酶活性测定试剂盒说明书方法进行。脲酶活力单位以每天每克土样中产生1 μg NH3-N表示，蔗糖酶活力单位以每天每克土样中产生1 mg还原糖表示，过氧化氢酶活力单位以每天每克土样催化1 μmol H2O2降解表示。
1.4 统计分析
试验数据利用Excel 2016和Origin 2019b进行处理和作图。采用SPSS 19.0进行单因素和多因素方差分析，多重比较采用最小显著差异法（LSD），于P＜0.05水平上进行统计显著性检验；
对土壤酶活性和水稳性团聚体指标的关系进行Pearson相关分析；
利用R软件的randomForest包构建随机森林模型，分析不同粒级团聚体含量对土壤团聚体稳定性（MWD和GMD）的影响。
2.1 不同施肥处理对土壤水稳性团聚体含量及分布的影响
由表1可看出，不同施肥处理土壤水稳性团聚体含量分布表现出明显差异。2020年，与CK相比，白菜季各施肥处理＞0.25 mm粒级水稳性团聚体累积含量均增加，OF和MF处理分别显著增加14.6%和13.3%（P＜0.05，下同）；
OF处理＞5 mm和2～5 mm粒级水稳性团聚体含量显著高于CK和CF处理，MF处理＞5 mm和1～2 mm粒级水稳性团聚体含量显著高于其他3个处理。而烟草季各施肥处理＞0.25 mm粒级水稳性团聚体累积含量均减少，OF和MF处理分别显著减少17.5%和15.5%；
OF处理1～2 mm、0.5～1 mm和0.25～0.5 mm粒级水稳性团聚体含量显著低于CK，MF处理0.5～1 mm粒级水稳性团聚体含量显著低于其他3个处理，CF处理＞5 mm和2～5 mm粒级水稳性团聚体含量较CK显著增加，而1～2 mm、0.5～1 mm和0.25～0.5 mm粒级水稳性团聚体含量显著减少。2021年，白菜季CF处理＞0.25 mm粒级水稳性团聚体累积含量显著低于其他3个处理，OF和MF处理较CF处理增幅分别为14.0%和13.9%；
OF处理1～2 mm、0.5～1 mm和0.25～0.5 mm粒级水稳性团聚体含量显著高于CF处理，MF处理＞0.25 mm各粒级水稳性团聚体含量均显著高于CF处理。烟草季，OF处理＞0.25 mm粒级水稳性团聚体累积含量较CF和MF处理分别显著增加6.8%和14.5%，OF处理＞5 mm粒级水稳性团聚体含量显著高于MF处理，使得其＞0.25 mm水稳性团聚体累积含量显著高于MF处理。总体而言，连续种植4季后，各处理＞0.25 mm粒级水稳性团聚体累积含量较初始土壤明显增加，生物有机肥施用促进团聚体形成的作用相对优于无机复合肥和复合微生物肥。
表1 不同施肥处理下土壤各粒级水稳性团聚体组成Table 1 Composition of soil water-stable aggregates in each size class under different fertilization treatments
此外，施肥种类、作物类型、试验年限、施肥种类与作物类型及3个因素间的交互作用对各粒级水稳性团聚体含量存在显著或极显著（P＜0.01，下同）影响，而施肥种类与试验年限的交互作用对2～5 mm、0.25～0.5 mm和＜0.25 mm粒级水稳性团聚体含量无显著影响（P＞0.05，下同），作物类型与试验年限的交互作用对2～5 mm和0.5～1 mm粒级水稳性团聚体含量无显著影响（表2）。
表2 施肥种类、作物类型、年限及其交互作用对各粒级水稳性团聚体含量的影响Table 2 Effects of fertilization types，crop species，year and their interactions on water-stable aggregate content
2.2 不同施肥处理对土壤水稳性团聚体稳定性的影响
MWD和GMD是反映土壤团聚体大小分布状况和评价其稳定性的重要指标，MWD和GMD越大表示团聚体的平均粒径团聚度越高，稳定性越强。由图1可知，2020年，白菜季各处理MWD和GMD均呈MF＞OF＞CF＞CK变化趋势，与CK和CF处理相比，OF和MF处理的MWD和GMD均显著增加，MF处理MWD和GMD均最大，分别为0.86和0.42 mm，较CK增幅分别为41.1%和27.4%。烟草季施肥处理的MWD和GMD均呈CF＞MF＞OF变化趋势；
CF处理MWD和GMD均最大，分别为1.22和0.51 mm，较CK增幅分别为30.3%和5.8%；
OF处理MWD和GMD均最小，分别为0.90和0.39 mm，较CK分别降低4.8%和17.9%。2021年，白菜季施肥处理MWD和GMD均大于CK，MWD和GMD增幅分别为16.7%～40.5%和1.8%～21.1%，其中MF处理MWD和GMD均最大，分别为1.18和0.69 mm，显著高于其他3个处理。烟草季，OF处理MWD和GMD均最大，分别为1.67和0.90 mm，较CF和MF处理，MWD分别显著增加7.9%和36.1%，GMD分别显著增加10.5%和32.2%。综上，连续施肥种植4季后，土壤水稳性团聚体稳定性明显增强，然而团聚体稳定性参数对作物类型和施肥种类的响应特征表现出明显差异，施用复合微生物肥有利于提高白菜季土壤团聚体稳定性，而施用生物有机肥有利于提高烟草季土壤团聚体稳定性。
图1 不同施肥处理下土壤水稳性团聚体的MWD和GMDFig.1 MWD and GMD of soil water-stable aggregates under different fertilization treatments
通过随机森林分析进一步发现（图2），各粒级团聚体含量对团聚体MWD的影响重要性依次为2～5 mm、＞5 mm、0.25～0.5 mm、1～2 mm、0.5～1 mm和＜0.25 mm，均方根误差增加值（IncMSE）分别为21.9%、18.9%、10.0%、9.6%、8.5%和6.2%；
各粒级团聚体含量对团聚体GMD 的影响重要性依次为2～5 mm、＞5 mm、＜0.25 mm、1～2 mm、0.5～1 mm和0.25～0.5 mm，IncMSE分别为19.2%、16.9%、14.9%、13.5%、7.1%和6.5%。由此可见，2～5 mm和＞5 mm粒级团聚体含量是影响团聚体MWD和GMD最主要的因子。
图2 各粒级团聚体含量对团聚体MWD和GMD的影响Fig.2 Effects of aggregate contents in each size class on MWD and GMD of aggregates
2.3 不同施肥处理对土壤酶活性的影响
土壤酶活性是土壤肥力的重要指标，不同施肥处理对白菜季和烟草季土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性的影响如图3所示。2020年，与CK相比，白菜季OF和MF处理土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性显著提高，CF处理土壤蔗糖酶和过氧化氢酶活性显著提高；
OF处理土壤脲酶和蔗糖酶活性较CF处理分别显著提高45.0%和54.5%，MF处理土壤脲酶和蔗糖酶活性较CF处理分别提高53.9%和2.6%，各施肥处理土壤过氧化氢酶活性无明显差异。烟草季OF处理土壤脲酶活性显著高于CK和CF处理，MF处理土壤蔗糖酶活性显著高于CK，而各施肥处理土壤蔗糖酶和过氧化氢酶活性无明显差异。2021年，白菜季CF处理土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性均显著低于CK，OF处理土壤蔗糖酶活性显著低于其他3个处理，而MF处理土壤脲酶和蔗糖酶活性显著高于其他3个处理。烟草季，OF和MF处理土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性均显著高于CF处理，增幅分别为11.9%～18.4%、62.7%～129.1%和6.7%～6.8%。从第1季到第4季，施肥处理土壤脲酶和蔗糖酶活性整体呈上升趋势，而土壤过氧化氢酶活性呈先升后降趋势，且同一季，施用复合微生物土壤脲酶和蔗糖酶活性均高于不施肥和施用无机复合肥，连续施肥种植4季后，与施用无机复合肥相比，施用生物有机肥和复合微生物肥的3种土壤酶均表现出较高活性。
图3 不同施肥处理下土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性Fig.3 Soil urease，sucrase and peroxidase activity under different fertilization treatments
此外，施肥种类、作物类型、试验年限及其交互作用对土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性存在显著或极显著影响（表3）。
表3 施肥种类、作物类型、年限及其交互作用对土壤酶活性的影响Table 3 Effects of fertilization types，crop species，year and their interactions on soil enzyme activity
2.4 土壤酶活性和水稳性团聚体指标的相关分析
土壤团聚体是影响土壤酶活性的重要因素。3种土壤酶活性与水稳性团聚体各粒级含量、MWD和GMD的Pearson相关分析表明（图4），土壤脲酶活性与2～5 mm和1～2 mm粒级水稳性团聚体含量呈极显著正相关，而与＜0.25 mm粒级水稳性团聚体含量呈极显著负相关；
土壤蔗糖酶活性与＞5 mm和2～5 mm粒级水稳性团聚体含量呈极显著正相关，与1～2 mm粒级水稳性团聚体含量呈显著正相关，而与0.5～1 mm和＜0.25 mm粒级水稳性团聚体含量呈显著负相关；
土壤过氧化氢酶活性与1～2 mm粒级水稳性团聚体含量呈显著正相关，而与0.25～0.5 mm粒级水稳性团聚体含量呈显著负相关。此外，3种土壤酶活性与MWD和GMD均呈正相关关系，且土壤脲酶和蔗糖酶活性与MWD和GMD相关性达极显著水平。
图4 土壤酶活性与水稳性团聚体指标的相关系数热图Fig.4 Correlation analysis between soil enzyme activity and water-stable aggregate indexes
耕作和施肥是影响土壤团聚体形成和稳定性的重要因素，长期单作和过量施用化肥会降低植烟土壤水稳性团聚体稳定性，而植烟土壤轮作和施用有机肥有利于改善土壤理化性质（Chen et al.，2020）。本研究中，连续施肥种植4季后，＞0.25 mm粒级土壤水稳性团聚体含量明显增强，然而团聚体稳定性参数（MWD和GMD）对作物类型和施肥种类的响应特征表现出明显差异，施用复合微生物肥有利于提高白菜季土壤团聚体稳定性，而施用生物有机肥有利于提高烟草季土壤团聚体稳定性。土壤团聚体稳定性的影响因素复杂多样，需综合考虑以下几个方面：（1）土壤胶结物质的种类和数量，如腐殖化有机质和多价金属离子复合体提供永久的黏结力、真菌菌丝和根系提供短期黏结力、土壤微生物和根系分泌的多糖提供临时黏结力（王清奎和汪思龙，2005；
周虎等，2009）。本研究中，生物有机肥或复合微生物肥施用进入土壤的有机碳可作为胶结物质，促进团聚体的形成并提高其稳定性（窦森等，2011），然而不同施肥处理土壤团聚体含量和稳定性存在差异，尤其是连续种植4季后，生物有机肥处理与复合微生物肥处理＞5 mm粒级水稳性团聚体含量、团聚体稳定性参数（MWD和GMD）差异显著。相关研究表明，施入有机肥后其分解残体激发微生物活性，有利于菌丝的生长和多糖的形成，这些物质通过物理和化学作用胶结土壤颗粒形成大团聚体（Whalen et al.，2003；
赵红等，2011）。Whalen等（2003）分析不同用量有机肥连续施用2年对土壤水稳性团聚体形成与稳定性的影响，发现有机肥施用有利于水稳性团聚体的形成，其中＞4 mm粒级水稳性团聚体含量增加最明显，且随有机肥施用量的增加而增加，第2年有机肥处理土壤中具有更多的＞4 mm粒级水稳性团聚体和更大的MWD。生物有机肥处理有机肥输入量远高于复合微生物肥处理，将影响土壤有机质含量及有机胶结物质种类和数量变化，可能是导致这2个处理土壤团聚体数量和稳定性差异的重要原因。（2）根际效应，根际是植物—土壤—微生物相互作用的主要场所，植物根系通过机械缠绕、根土粘附和根系生化作用（养分吸收、分泌物释放等），导致根际土壤物理、化学和生物学性质的变化，从而影响土壤团聚化过程（苑亚茹等，2012；
李娜等，2013；
Li et al.，2020）。然而，由于根系的特征、根系分泌物类型和功能的不同，不同植物根系对土壤团聚化的作用不同（Chan and Heenan，1999；
Bodner et al.，2014；
Li et al.，2020）。苑亚茹等（2012）研究发现，玉米、小麦和大豆3种作物根际土壤团聚体在组成上并无显著差异，而玉米根际土壤团聚体稳定性显著高于小麦和大豆。本研究中，与白菜根系相比，烟草根系更发达，且分布深度和宽度均较大，根系的机械缠绕固定作用、有效根密度、释放的分泌物不同，导致根际效应的差异，最终表现出施用复合微生物肥对烟草季土壤团聚体稳定性提升效果不及白菜季。因此，需要基于植烟土壤根际效应和烟草根系形态特征，进一步研究土壤结构稳定性对不同有机无机配比的复合微生物肥施用的响应特征，为研制更有效的烟草专用复合微生物肥提供参考依据。
土壤酶促作用在土壤物质和能量循环及转化过程中扮演重要角色，土壤酶活性被认为是土壤肥力和土壤质量的重要生物学指标，其中脲酶与氮的转化密切相关，蔗糖酶与碳循环存在密切联系，过氧化氢酶有利于防止H2O2积累对生物体的毒害作用，常被用作敏感的关键土壤酶学指标，以反映土壤的健康状况（武雪萍等，2005；
张美存等，2017）。本研究中，连续种植4季，施肥处理土壤脲酶和蔗糖酶活性呈上升趋势，而土壤过氧化氢酶活性呈先升后降趋势，且同一季，施用复合微生物土壤脲酶和蔗糖酶活性均高于不施肥和施用无机复合肥，连续施肥种植4季后，与施用无机复合肥相比，施用生物有机肥和复合微生物肥的3种土壤酶均表现出较高活性。这与其他有关微生物菌剂、生物有机肥或生物有机无机复混肥施用对土壤酶活性影响的研究报道一致（邵丽等，2012；
曲成闯等，2019；
姜永雷等，2022；
张德楠等，2022）。姜永雷等（2022）研究发现不同连作年限植烟土壤胞外酶活性在施用微生物菌剂后均得到不同程度改善；
邵丽等（2012）在等养分量条件下施用无机肥、有机无机复混肥、生物复混肥后发现土壤脲酶、蔗糖酶活性均以生物复混肥处理最高。其原因可能是由于生物有机肥和复合微生物肥施用较无机肥具有以下优点：一是营养元素齐全，且含有丰富的有机质和多种功能菌，能提供更多、更丰富的酶促基质（武雪萍等，2005）；
二是可改善土壤团聚体的结构和稳定性，为土壤微生物提供良好的微生态环境，刺激相关微生物大量繁殖和代谢水平提高（王清奎和汪思龙等，2005；
万忠梅和吴景贵，2005；
李娜等，2013）；
三是可促进根系生理代谢，根分泌物为根际微生物提供更多营养和能源物质，从而提高根际微生物的数量和活性（张福锁和曹一平，1992）。然而，连续种植多季后，土壤过氧化氢酶活性下降可能是由于作物对某些元素的选择性吸收，尤其是与酶活性关系密切的微量元素，造成土壤养分不平衡（张福锁和曹一平，1992）；
此外，根系分泌的有机酸、酚类等物质及土壤有机质分解过程中的中间产物，随种植年限的增加逐渐积累，进而影响土壤微生物的数量、种群多样性、代谢活动及作物自身的生长发育（张福锁和曹一平，1992；
曲成闯等，2019）。还有研究表明，土壤酶活性在植物与土传病原菌相互作用中也扮演重要角色（卢维宏等，2020）。史普酉等（2020）通过调查不同烟区未植烟土壤、健康烟株土壤与发病烟株土壤脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶与蔗糖酶活性发现，发病烟株根际土壤酶活性均低于未植烟土壤与健康烟株土壤，且酶活性随发病程度增加均呈下降趋势。本研究未对比分析健康烟株与发病烟株根际土壤酶活性的变化情况，有关土壤酶活性变化对复合微生物肥长期施用的响应特征及其与烟株生长及抗病性之间的关系还有待深入研究。
与施用无机复合肥相比，施用生物有机肥对植烟根际土壤团聚体的形成和稳定及土壤脲酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性有协同改善效应；
施用复合微生物肥对植烟根际土壤团聚体形成和稳定性的改善作用不明显，而对土壤酶活性有明显促进效应。因此，为使烟草专用复合微生物肥发挥保育与修复植烟土壤最大潜力，需注重优化有机肥、无机肥、功能微生物配置，并在此基础上进一步结合田间试验摸索适宜用量，以达到优质烤烟可持续发展的目的。
