徐丽谭钺宗晓娟吴举彬 魏海蓉
(1.山东省果树研究所，山东 泰安 271000；
2.沂源县农业农村局，山东 沂源 256100)
WRKY家族是植物中最大的转录因子家族之一，其成员具有一个或两个高度保守的WRKY结构域，N端包含一个保守的WRKYGQK七肽序列，C端包含一个C2H2或C2HC锌指基序[1，2]。根据WRKY结构域的数量和C端锌指基序的结构，WRKY家族可分为三类:Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类[1]。自第一个WRKY蛋白(SPF1)[3]被发现以来，WRKY转录因子在植物中的功能研究取得了很大进展，发现WRKY在响应生物和非生物胁迫以及在植物信号传导、生长发育调控中发挥着重要作用[4-7]。例如拟南芥的AtWRKY18、AtWRKY33和AtWRKY46已被证明参与病原体和水杨酸(SA)介导的 防 御 反 应[8-11]；
AtWRKY8、AtWRKY25、At-WRKY33和AtWRKY47参与非生物胁迫反应[12-15]；
AtWRKY71结合到FT和LFY的启动子上，通过上调其表达，加速拟南芥的开花[16]；
At-WRKY71可被H2O2、ABA和甘露醇快速诱导，可能在植物对非生物胁迫的响应中发挥作用[17]；
水稻的OsWRKY71和OsWRKY51共同参与GA和ABA信号通路，控制α-淀粉酶活性，调节种子休眠[18]；
OsWRKY71可以通过调控下游基因OsTGFR和WSI76的表达来提高转基因水稻植株的耐寒性[19]；
转小麦TaWRKY71的拟南芥通过促进IAA向MeIAA转化，改变生长素稳态水平，从而引起叶片休眠[20]；
香蕉的MaWRKY31、MaWRKY33、MaWRKY60和MaWRKY71基因表达在冷藏期间受ABA处理诱导，并且能直接结合到MaNCED1和MaNCED2基因启动子的W-box上激活其表达[21]。目前关于WRKY基因功能的研究主要集中在草本植物如拟南芥、小麦、烟草、水稻中，在木本植物中报道的非常少，关于WRKY71转录因子在甜樱桃砧木中的功能研究尚未见报道。
砧木是限制甜樱桃生产的关键问题之一。甜樱桃矮化砧木吉塞拉(Prunus cerasus×Prunus canescens)是将酸樱桃与灰毛叶樱桃进行种间杂交培育出的三倍体杂种，目前是甜樱桃生产中最受欢迎的矮化砧木[22，23]，但是该品种的根系发育较弱，对寒冷、干旱和盐分等环境胁迫的抵抗力较差，因此改善其抗逆性迫在眉睫。由于杂交的杂合性和多倍体性，利用传统的杂交育种方法改良甜樱桃砧木比较困难，而且周期较长，利用单基因或多基因遗传转化是有效改善该品种存在问题的一种有效方法，其中关键基因的挖掘是前提。鉴于WRKY基因在植物抵抗生物和非生物胁迫中的重要性，我们以甜樱桃砧木‘Gisela 6’为材料，对其WRKY71转录因子进行功能鉴定，可为甜樱桃砧木抗逆品种选育提供理论依据和技术支持，并为甜樱桃的分子设计育种提供基因资源。
1.1 植物材料培养与处理
本试验于2021年在山东省果树研究所完成。甜樱桃砧木‘Gisela 6’组培苗在附加0.5 mg/L 6-BA、30 mg/L蔗糖和6 mg/L琼脂的MS基本培养基上继代培养，置于26℃恒温培养箱(光照16 h、黑暗8 h)中培养3周后，分别转移到添加200 mmol/L甘露醇、200 mmol/L NaCl、200 mmol/L茉莉酸甲酯(MeJA)和150 mmol/L水杨酸(SA)的培养基上，另将部分组培苗置于4℃培养箱中进行低温胁迫处理，每个处理重复3次，每个重复9瓶。分别于处理0、2、4、6、12、24、48 h取组培苗叶片。放入液氮冷冻后保存于-80℃冰箱备用。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA的提取与PcWRKY71基因的克隆利用植物总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取‘Gisela 6’叶片总RNA，然后按照One-Step gDNA removal and cDNA synthesis试剂盒(全式金生物技术有限公司，北京)说明书进行反转录合成cDNA。
根据甜樱桃转录组和基因组数据，设计合成PcWRKY71基因全长引物PcWRKY71-F(5′-CTACTTCCATGTCTGATCATGAAC-3′)和Pc-WRKY71-R(5′-AAGATGATCGTGATGAGAGGAG-3′)。以反转录合成的cDNA为模板PCR扩增PcWRKY71全长序列。PCR反应体系包括2×Phanta®Max Buffer 25μL、Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL、10 mmol/L dNTP Mix 1μL、10μmol/LPcWRKY71-F 2μL、10μmol/LPc-WRKY71-R 2μL和cDNA 2μL，ddH2O补足至50 μL。PCR反应程序为95℃预变性3 min；
95℃变性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸1 min，35个循环；
最后72℃延伸5 min。
PCR扩增产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)切胶回收，将回收的目的片段连接到pEASY-Blunt载体上(全式金生物技术有限公司，北京)，然后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，在氨苄青霉素抗性的LB平板培养基上培养，挑取单个菌落进行PCR扩增检测，阳性菌落送生工生物工程(青岛)股份有限公司测序。
1.2.2PcWRKY71基因的生物信息学分析 用NCBI在线ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)预测PcWRKY71基因的开放阅读框。用ProtParam(http://us.expasy.org/tools/ProtParam.html)预测基因编码蛋白的分子量和等电点等；
利用ProtScale软件(http://www.expasy.org/cgibin/protscale.pl)分析氨基酸序列的疏/亲水性；
用Plant-mPLoc软件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)预测其亚细胞定位；
利用MEGA 7.0软件邻位相连法(Neighbor-Joining，NJ)构建不同物种WRKY71蛋白序列的系统进化树。
1.2.3 qRT-PCR检测PcWRKY71在不同处理下的表达模式 利用试剂盒分别提取甘露醇、NaCl、MeJA、SA和4℃低温处理后‘Gisela 6’组培苗叶片的总RNA，反转录合成cDNA，然后利用qRTPCR检测PcWRKY71基因在不同处理下的表达量。qRT-PCR的引物为qF(5′-GATAAGCATCAATCACAAC-3′)和qR(5′-TGTAATCCATAGGTCCTT-3′)，以甜樱桃β-actin基因(accession no.FJ560908)作为内参，参照Ultra SYBR mixture with Rox试剂盒(康为)说明书，利用ABI7500型荧光定量PCR仪进行扩增。qRT-PCR反应条件:95℃变性10 min；
95℃变性15 s，55℃退火1 min，72℃延伸40 s，40个循环。基因相对表达量根据2-ΔΔCt方法计算。
2.1 PcWRKY71基因克隆与序列分析
以甜樱桃砧木‘Gisela 6’叶片提取RNA反转录合成的cDNA为模板，以PcWRKY71-F和Pc-WRKY71-R为引物扩增获得约1 000 bp大小的目的片段，经测序分析，该片段大小为1 095 bp。经NCBI的ORF Finder分析表明，PcWRKY71基因起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，开放阅读框为1 014 bp，编码氨基酸337个(图1)。通过核苷酸序列分析发现PcWRKY71有1个WRKY保守结构域和1个C2H2的锌指基序(图1)，表明其属于WRKY家族第Ⅱ类成员。Prot-Param软件分析结果表明，PcWRKY71编码蛋白分子量为37.41 kDa，理论等电点为6.72，不稳定系数为57.13，属于不稳定蛋白；
亲水性平均数(GRAVY)为-0.960，表明该蛋白亲水性氨基酸的数量高于疏水性氨基酸数量，预测该蛋白为亲水性蛋白。经Plant-mPLoc软件预测，PcWRKY71定位在细胞核上。
图1 PcWRKY71基因的cDNA序列及预测的氨基酸序列
利用NCBI的BLAST程序进行序列比对，Pc-WRKY71基因序列与梅(XP＿008225356)、碧桃(XP＿007214251)、苹果(XP＿008383508)和白梨(XP＿009353824)的WRKY71基因的核苷酸序列相似性分别为96%、94%、76%和75%。综上，分离得到的cDNA序列是甜樱桃砧木‘Gisela 6’的WRKY71基因，GenBank登录号为MG450655。
2.2 PcWRKY71系统进化分析
为了分析PcWRKY71蛋白与其它植物同源蛋白的进化关系，在NCBI下载甜樱桃、樱花、梅、扁桃、碧桃、苹果、白梨、野草莓、可可、陆地棉和野茶树的WRKY71蛋白序列，通过MEGA 7.0构建系统进化树。结果表明，甜樱桃砧木与甜樱桃和樱花亲缘关系最近，与陆地棉和野草莓亲缘关系较远(图2)。
图2 PcWRKY71转录因子与其他植物的WRKY71转录因子氨基酸序列的进化树分析
2.3 PcWRKY71基因在非生物胁迫下的表达分析
为探究PcWRKY71是否参与甜樱桃砧木对干旱、盐害和低温胁迫的响应，利用qRT-PCR方法对其在不同逆境胁迫下的表达情况进行分析，结果显示，在甘露醇胁迫下，PcWRKY71基因的表达量在处理2 h开始升高，12 h达到最大值，之后下降，每一个时间点的表达量均高于未处理时(图3)。NaCl胁迫后，PcWRKY71基因上调表达，在处理2 h快速上升，48 h达到最大值(图4)。4℃低温胁迫2 h，PcWRKY71基因表达量开始升高，6 h时表达量低于对照(0 h)，24 h表达量达到最大值(图5)。表明干旱、盐和低温胁迫均能诱导Pc-WRKY71表达，尤其受甘露醇和NaCl胁迫诱导明显。
图3 200 mmol/L甘露醇处理下PcWRKY71基因的表达
图4 200 mmol/L NaCl处理下PcWRKY71基因的表达
图5 4℃低温处理下PcWRKY71基因的表达
2.4 PcWRKY71基因在激素处理下的表达分析
SA和MeJA是植物防御病原菌侵染的两个重要信号分子。为了明确PcWRKY71基因表达是否受激素影响，我们分析了SA和MeJA处理下PcWRKY71的表达量变化，结果显示，在SA处理48 h内，PcWRKY71基因表达量逐渐增加，但均低于对照(0 h)，说明SA对PcWRKY71具有负调控作用(图6)；
MeJA处理对PcWRKY71表达具有正调控作用，表达量均高于对照(0 h)，且在处理48 h内先上升后下降，在处理6 h达到最大值(图7)。
图6 150 mmol/L水杨酸处理下PcWRKY71基因的表达
图7 200 mmol/L茉莉酸甲酯处理下PcWRKY71基因的表达
WRKY71作为WRKY转录因子家族的一员，在调控植物生长发育和逆境胁迫等方面具有重要功能[16，20，24]。本研究从甜樱桃砧木中克隆得到PcWRKY71基因，其编码的蛋白具有典型的WRKY结构域WRKYGQK，属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族，预测是一个不稳定的亲水性蛋白，亚细胞定位于细胞核上，这与水稻和香蕉的WRKY71转录因子的核定位结果一致，说明它可能在细胞核中起作用[25，26]。系统进化分析显示甜樱桃砧木与甜樱桃和樱花的亲缘关系最近，与其都属于蔷薇科樱亚属一致。
WRKY转录因子是植物对胁迫反应信号转导的重要组成部分。在水稻中OsWRKY71特异受冷胁迫诱导，正向调控水稻的抗寒性，但不受ABA、盐、干旱处理的影响[19]。红麻的HcWRKY71基因受盐、干旱和重金属镉胁迫诱导表达，转Hc-WRKY71基因提高了转基因拟南芥幼苗的耐盐性[27]。我们对甜樱桃砧木进行干旱、盐害和低温胁迫处理，结果表明PcWRKY71表达受干旱和盐胁迫上调表达，对两种胁迫的响应模式基本一致，均在处理2 h开始上调表达，分别在12、48 h表达量最高。PcWRKY71对低温处理的响应仅在处理6 h时下调表达，其它时间均上调表达。因此推测PcWRKY71表达受多种非生物胁迫影响，但对不同胁迫的响应程度不同。
通过低温、脱水、盐胁迫、ABA、H2O2、乙烯、SA和MeJA处理，香蕉幼苗中MusaWRKY71的表达显著上调，表明MusaWRKY71能响应多种胁迫[26]。水稻的OsWRKY71能被SA、MeJA、ACC多种防御信号分子上调，并在损伤和病原菌感染时上调，表明OsWRKY71可能在水稻生物胁迫应答中起作用[25]。为分析激素对PcWRKY71表达模式的影响，对甜樱桃砧木进行SA和MeJA处理，结果显示SA处理显著抑制了PcWRKY71表达，这与在香蕉和水稻中的研究结果不同，说明不同物种中WRKY71基因对激素的应答存在一定差异。MeJA处理后PcWRKY71上调表达，处理6 h表达量达到最高值，说明PcWRKY71基因可能在植物MeJA介导的信号途径中起正调控作用，这与WRKY71在香蕉和水稻中的研究结果一致。
综上所述，本研究从甜樱桃砧木中克隆了PcWRKY71转录因子序列，具有典型的WRKY结构域，属于第Ⅱ类WRKY转录因子家族。Pc-WRKY71基因受干旱、盐害和低温等非生物胁迫诱导表达，并受激素SA和MeJA影响。本研究结果可为进一步揭示PcWRKY71基因的功能以及研究其在调节樱桃抗逆性和响应植物激素过程中的作用提供参考。
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