吴国明，张 盈，王 楠
(1.浙江中医药大学附属江南医院 骨科，浙江 杭州 311201；
2.萧山区第一人民医院 妇科，浙江 杭州 311201)
临床常见因各种外伤所致的肌腱损伤[1-2]，肌腱损伤在自我修复过程中可能会造成粘连。严重肌腱损伤一般需要手术治疗，而手术治疗可能继发的粘连性更大，并会严重影响关节功能。因此，如何防止肌腱损伤修复过程中的粘连是临床上迫切需要解决的科学问题。成纤维细胞的增殖是肌腱损伤修复过程中形成粘连的重要因素[3]。可抑制成纤维细胞增殖的药物主要有5-氟尿嘧啶(5-Fu)、6-磷酸果糖等[3]，但局部给药后，上述药物很快就会泄露至机体循环系统内，造成局部的药物有效浓度过度降低。因此，为维持肌腱局部治疗的有效药物浓度水平，需要频繁给药，不仅提高了药物的毒副作用，而且增加肝肾负担，从而降低了患者的依从性。为此，我们制备了5-Fu的缓释剂型(即负载5-Fu的PLGA微球)，观察其对体外培养的大鼠肌腱成纤维细胞的抑制作用，从而为确证5-Fu的新型缓释剂是否能有效调节和预防术后肌腱的粘连提供实验基础。
1.1 仪器设备 冷冻干燥机(FD-1A-50，上海)，旋转蒸发仪(RE-501，山东)，匀浆机(S10，上海)。
1.2 主要药品与试剂 5-氟尿嘧啶(5-FU)(美国Sigma-Aldrich公司)；
聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)(货号：P133293，阿拉丁公司)；
明胶(货号：G108398，阿拉丁公司)及二氯甲烷(货号：G1238N，西陇化工股份有限公司)。
1.3 细胞、生化试剂及抗体 大鼠成纤维细胞系(RAT-1)由本院实验室保存。完全培养基：DMEM 90%；
胎牛血清10%(Thermo Fisher Scientific，货号:11965092)。培养条件：37 ℃，5%二氧化碳。DMEM基础培养基及胎牛血清购自Thermo Fisher公司。PVDF膜购自Millipore公司(Thermo Fisher Scientific，货号：88518)。CCK-8试剂盒(用于细胞增殖分析)购自日本同仁化学研究所(Dojindo，货号：39580)。ROS检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所(货号：S00335)。AKT(Abcam,货号：6532)、p-AKT(货号：3420)、Bax(货号：2898)、Bcl-2(货号：3689)、GAPDH(货号：8924)抗体，均购自美国Cell Signaling Technology(Danvers，Mass)。EdU试剂盒购自锐博生物科技有限公司。ANNEXINV-FITC/PI购自北京索莱宝公司(货号：589214)。
1.4 PLGA微球制备 配制明胶溶液备用。采用复乳溶剂蒸发法，将200 mg PLGA溶解在2 mL二氯甲烷溶液中，将20 mg 5-氟尿嘧啶加入上述溶液中做为油相，充分溶解后加入到10 mL的2%明胶溶液中，用手持式匀浆机在10 000 r/min高速搅拌60 s，形成初乳溶液；
迅速将初乳溶液倒入100 mL的0.5%PVA中，冰浴下10 000 r/min搅拌10 s，形成复乳溶液;将复乳溶液倒入500 mL的0.5%明胶溶液中，室温下磁力搅拌2 h,减压蒸馏6 h去除其中残余的有机溶剂，10 000 r/min离心10 min，去离子水洗3次，将沉淀冷冻干燥可得到PLGA微球载5-氟尿嘧啶粉末，4 ℃保存。
1.5 Western-blot分析 5-Fu-PLGA微球处理RAT-1成纤维细胞后，采用Western-blot检测胞内信号分子(AKT、mTOR)、增殖相关基因蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Survivin)、凋亡相关基因蛋白(Bax、Bim)的表达水平，操作过程严格按照说明书进行。使用伯乐ChemiDoc XRS+成像系统观察荧光条带。
1.6 DCFH-DA荧光检测成纤维细胞活性氧含量 将成纤维细胞(RAT-1)密度调整为2×105/mL，然后，将细胞接种于6孔板中，再将5-Fu-PLGA微球加入培养液中，并继续培48 h洗涤细胞后加入DCFH-DA(实验步骤按照说明书操作指南)。37 ℃细胞培养箱内孵2 min。每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次后，置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
1.7 CCK-8检测RAT-1细胞增殖能力 将RAT-1细胞培养至对数生长期，然后将细胞以4×105每孔的密度接种于96孔细胞培养板中，每个处理组至少设立3个重复孔，将细胞培养板放入培养箱中培养。当细胞完全贴壁后,分别加入5-氟尿嘧啶的PLGA微球，并培养至不同的时间节点后,将CCK-8检测溶液加入并在37 ℃条件下继续孵育3.5 h，使用酶标仪(450 nm)检测每孔的吸光度。
1.8 细胞凋亡的检测 使用5-Fu-PLGA微球刺激纤维细胞(RAT-1)，洗涤2次后，使用ANNEXINV-FITC/PI检测试剂盒检测成纤维细胞的凋亡情况。实验过程严格参照索莱宝的试剂盒进行。
2.1 5-Fu-PLGA微球制备成功 按照上述的技术方法，成功制备5-Fu-PLGA微球，见封三图1。扫描电镜观察可见微球呈正圆形，粒径约为20 μm左右，形态规整。
2.2 5-Fu-PLGA微球对成纤维细胞增殖的影响 分别使用1、5、10、20 mg的PLGA微球处理成纤维细胞24～72 h后，经CCK-8检测，结果显示：不 同浓度的5-氟尿嘧啶的PLGA微球能够以剂量依赖性的方式抑制成纤维细胞的增殖。见图1。
图1 5-Fu-PLGA微球抑制成纤维细胞的增殖
2.3 5-Fu-PLGA微球对相关蛋白的影响 Western-blot检测结果显示，5-Fu-PLGA微球处理成纤维细胞后，AKT、Juk、mTOR及Bcl-2、Bcl-xL、Survivin的表达水平低于对照组，Bax、Bim的表达水平高于对照组(PLGA微球)，差异均有统计学意义(P<0.05)；
但在磷酸化的ERK1/2和p38MAPK表达中未观察到明显影响(P>0.05)。见图2。
注：与对照组比较，*P<0.05。
2.4 5-Fu-PLGA微球诱导成纤维细胞氧化应激 单纯处理PLGA微球的成纤维细胞(对照组)内 ROS含量，高于5-Fu-PLGA微球处理的成纤维细胞内 ROS含量，差异有统计学意义(P<0.05)。见封三图2。
2.5 EdU检测5-Fu-PLGA微球对成纤维细胞增殖的影响 细胞增殖EdU检测结果显示，5-Fu-PLGA微球组荧光细胞阳性率明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。
注：与对照组比较，*P<0.05。
2.6 5-氟尿嘧啶的PLGA微球成纤维细胞凋亡的影响 Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测分析5-Fu-PLGA微球对成纤维细胞凋亡的影响，结果表明，与对照组相比，PLGA 5-Fu-PLGA微球引起细胞凋亡的比例显著提高，差异有统计学意义(P<0.05)。见封三图3。
肌腱损伤在自我修复过程中可能会造成粘连，严重者可能会影响关节功能。因此，如何预防肌腱损伤修复过程中的粘连是一个亟待解决的临床问题[1]。以往研究表明,引起肌腱形成粘连的因素主要包括：1) 来源于周围组织的成纤维细胞向肌腱断开方向增殖生长，这是引起粘连最核心的因素之一；
2) 炎症也是造成肌腱粘连的因素之一；
3) 受伤后，肌腱细胞的自我增殖修复可能会与周围组织的成纤维细胞密切相关，进而可能引发粘连。因此，在肌腱损伤修复过程中抑制成纤维细胞的增殖，是解决肌腱粘连的方法之一。5-氟尿嘧啶虽能够抑制成纤维细胞的增殖，但由于其药物本身的特性，给药后的5-氟尿嘧啶会发生泄露至循环系统的现象，引起药物浓度迅速降低。PLGA是一种高分子聚合物材料，由于PLGA拥有良好的生物可降解性能，因此PLGA已被广泛用作缓控释系统的骨架材料，并已经有以PLGA为载体的药品上市[3-4]。
本研究中，我们使用PLGA作5-氟尿嘧啶载体材料，研制了5-Fu-PLGA微球缓释剂。通过这种缓释、控释的给药方式，可以在较长的一段时间内持续释药，维持药物的有效治疗浓度，避免局部高药物浓度引起的刺激作用。
本研究中，我们首先使用成纤维细胞模型在体外评估5-Fu-PLGA微球缓释剂的潜在生物活性，结果发现：5-氟尿嘧啶的PLGA微球缓释剂能够抑制成纤维细胞的增殖，抑制AKT和mTOR信号通路的活化；
可以抑制抗凋亡基因Bcl-2，Bcl-xL和Survivin的表达，并增加了凋亡基因Bax及Bim的表达；
但对ERK1/2和p38MAPK信号通路的激活没有显著的影响；
进一步分析还发现5-Fu-PLGA微球可以显著提高ROS的水平，促进成纤维细胞的凋亡。
5-氟尿嘧啶(5-Fu)属于抗代谢类的药物，能干扰DNA的合成进而抑制细胞的增殖，临床上主要用于治疗肿瘤。近年来，研究人员发现5-Fu可明显降低肌腱周围组织中成纤维细胞的含量。他们将5-Fu应用于兔肌腱局部，结果发现5-Fu可显著降低受损肌腱细胞的增殖，并能有效提高肌腱术后的功能恢复[5-6]。研究表明,不同浓度的5-Fu溶液作用于鸡的肌腱断端，发现其能显著降低术后肌腱粘连的程度。但由于5-Fu在体内的半衰期非常短，只有10～20 min，这在很大程度上限制了5-Fu在治疗中的具体应用[5]。PLGA具有出色的生物相容性和可生物降解性，微球缓释给药可延长5-Fu的半衰期。席宁等[7]制备了姜黄素的PLGA纳米微球，并发现其具有良好的缓释特性。此外，刘梓昕等[8]全面地综述了PLGA微球的抗肿瘤作用。为了提高5-Fu的应用潜力，我们在总结一系列前人研究的基础上，使用PLGA作为5-氟尿嘧啶载体材料，研制了负载5-Fu的PLGA微球缓释剂，并通过一系列的实验验证了其生物活性。因此，负载5-Fu的PLGA微球作为缓释剂型用于防治肌腱粘连具有广阔的前景[9-10]。
综上，5-氟尿嘧啶的PLGA微球缓释剂具有良好的生物学性能，能够显著抑制成纤维细胞的增殖，促进成纤维细胞凋亡，这为其进一步在体内进行相关的临床试验奠定了良好的基础。
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