高云逸 ，孟淑华 ，肖瑶 ，魏军平
1.北京中医药大学，北京 100029；
2.北京市西城区广外医院，北京 100055；
3.中国中医科学院广安门医院，北京 100053
桥本甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）又称慢性淋巴细胞性甲状腺炎，是一种自身免疫性甲状腺炎。甲状腺在组织胚胎学上由原始消化管的前肠部分分化而来。肠道菌群参与宿主的代谢、免疫调节、维持胃肠道稳态等生理活动[1]。既往研究表明，实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠肠道菌群组成发生明显变化，其中厚壁菌门Firmicutes相对丰度显著升高，拟杆菌门Bacteroidetes相对丰度下降[2]，因此肠道菌群物种组成和丰度改变可能与HT相关。HT属中医学“瘿病”范畴，现代医家多认为，HT与情志不畅有关[3-4]。肝喜条达而恶抑郁，肝失疏泄则气机郁结，肝木克脾土，则脾气受损，水液运化失司，痰气互结于颈部而发病。一项关于新诊断HT的横断面研究结果显示，肝郁脾虚证占观察人数的63.3%[5]，因此，我们认为肝郁脾虚为本病的主要特点，贯穿始终。本研究采用肠道菌群分析法对HT肝郁脾虚证患者、HT非肝郁脾虚证患者和健康人群进行肠道菌群检测，以观察HT及HT肝郁脾虚证患者肠道菌群特征。现报道如下。
1.1 病例来源
选取2020年10月－2021年12月中国中医科学院广安门医院、北京市西城区广外医院内分泌门诊HT患者。同时纳入健康体检者10例为健康对照组。
1.2 诊断标准
1.2.1 西医诊断标准
依据《中国甲状腺疾病诊治指南——甲状腺炎》[6]制定HT诊断及分期标准。
1.2.2 中医辨证标准
参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》[7]制定肝郁脾虚证辨证标准。主症：胃脘或胁肋胀痛，腹胀，食少纳呆，便溏不爽；
次症：情绪抑郁或急躁易怒，善太息，肠鸣矢气，腹痛即泻，泻后痛减，舌苔白或腻，脉弦或细。符合主症3项，或主症2项、次症2项即可明确辨证。非肝郁脾虚证参考《中医常见证诊断标准》[8-9]进行辨证。
1.3 纳入标准
HT患者：①年龄18～65岁；
②符合上述西医诊断标准；
③近3个月未服用中药（包括中成药、成分明确的汤剂和成分未知的方药等）；
④近3个月未服用硒制剂；
⑤近6个月未服用抗生素类药物；
⑥近3个月未服用益生菌/益生元或其他微生态调节剂；
⑦近6个月未罹患急性胃肠炎等肠道相关疾病。符合肝郁脾虚证辨证标准者纳入HT肝郁脾虚组，其他证型者均纳入HT非肝郁脾虚组。
健康对照组：①年龄18～65岁；
②无HT相关疾病或相关疾病家族病史；
③近3个月未服用中药（包括中成药、成分明确的汤剂和成分未知的偏方等）；
④近3个月未服用益生菌/益生元或其他微生态调节剂；
⑤近6个月未患有感染性疾病或服用抗生素类药物；
⑥近6个月未罹患急性胃肠炎等肠道相关疾病。
1.4 排除标准
①合并Graves病者；
②妊娠或备孕妇女、哺乳期妇女；
③有严重心、肝、肾、脑、血液系统等并发症或合并其他严重原发性疾病、精神病患者；
④不能配合完成试验期间实验室检查及问卷调查者。
1.5 调查内容
①受试者一般资料，包括性别、年龄、身高、体质量、体质量指数（BMI）等；
②甲状腺功能及自身抗体水平：血清游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）、总三碘甲状腺原氨酸（TT3）、总甲状腺素（TT4）、促甲状腺激素（TSH）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPO-Ab）、甲状腺球蛋白抗体（Tg-Ab）；
③甲状腺超声检查结果；
④中医基本症状，如是否有脘胁胀痛，食少纳差，腹痛欲泻、泻后痛减，情绪抑郁，烦躁易怒等。
1.6 16S rRNA基因测序
受试者签署知情同意书后，研究人员准备粪便样本收集套装并收集受试者新鲜粪便样本2 g，立即放入-80 ℃冰箱保存。随后使用常规方法提取DNA、设计引物、PCR扩增、产物纯化、检测纯度和浓度，构建文库、测序，并根据样本物种信息进行丰富度和结构分析、差异性比较。
1.7 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析。正态分布数据以±s表示，所有正态分布、方差齐数据2组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2.1 一般信息
HT肝郁脾虚组9例，均为女性，平均年龄（41±12）岁，BMI（22.33±1.66）kg/m2；
HT非肝郁脾虚组12例，包括男性2例、女性10例，平均年龄（39±10）岁，BMI（23.83±2.21）kg/m2；
健康对照组10例，包括男性1例、女性9例，平均年龄（37±12）岁，BMI（21.90±1.79）kg/m2。3组受试者性别、年龄、BMI比较差异无统计学意义（P>0.05）。性别分布符合既往HT流行调查研究结果[10]。
2.2 桥本甲状腺炎患者甲状腺功能及自身抗体水平
HT肝郁脾虚组患者甲状腺功能正常6例，亚甲减期3例，甲减期0例；
HT非肝郁脾虚组患者甲状腺功能正常6例，亚甲减期6例，甲减期0例。2组甲状腺功能及自身抗体水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.3 肠道菌群分析结果
本研究受试者31个样本经序列拼接、过滤后，共产生1 280 526个序列。使用USEARCH根据序列相似度将序列聚类为操作分类单元（OTU），相似度阈值为97%，将稀有序列弃去，最终共聚类为16 941个OTU，以OTU为基础进行多样性分析。
2.3.1 OTU数目及物种丰度
一组含有多个样本时，若检测到某个OTU的样本数达到50%以上，则认为这一组含有该OTU。HT非肝郁脾虚组、HT肝郁脾虚组、健康对照组肠道菌群样品平均OTU数目分别为（601±250）个、（442±176）个、（623±177）个，其中健康对照组肠道菌群OTU数目较多，但3组比较差异无统计学意义（P=0.086）。各组间共有和各自特有OTU数目即OTU组成相似性及重叠情况见图1。3组共有的OTU共171个，HT肝郁脾虚组、HT非肝郁脾虚组、健康对照组特有的OTU分别为39个、16个、210个。
图1 3组受试者肠道菌群OTU Venn图
2.3.2 OTU主坐标分析
主坐标分析（PCoA）结果见图2。与HT患者肠道菌群样本相比，健康对照组肠道菌群样本OTU组成分布相对集中，表明健康对照人群肠道菌群主成分相似度高于HT患者。
图2 3组受试者肠道菌群OTU PCoA二维图
2.3.3 Alpha多样性比较
Alpha多样性包括丰富度、均匀度、多样性等，使用mothur计算Alpha多样性指数。sobs表示观察到的物种数，即OTU数；
chao指数和ace指数反映样品中群落的丰富度；
shannon指数越大表明多样性越高；
simpson指数越小表明多样性越高。HT肝郁脾虚组多样性较高，但与其他2组相比差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
表1 3组受试者肠道菌群Alpha多样性指数（±s）
表1 3组受试者肠道菌群Alpha多样性指数（±s）
指数sobs chao ace shannon simpson HT肝郁脾虚组601.22±249.81 716.43±262.19 726.44±266.55 3.28±0.99 0.17±0.13 HT非肝郁脾虚组442.08±176.35 557.40±194.09 578.70±211.08 2.63±0.92 0.24±0.16健康对照组622.50±176.76 765.10±188.97 776.20±200.96 3.23±0.55 0.17±0.10 F值2.688 2.853 2.306 2.011 1.011 P值0.086 0.075 0.118 0.153 0.377
2.3.4 物种分布及其丰度比较
以目、属分类水平为例，本研究所有样品共注释到20个优势菌目、39个优势菌属（不包含unclassified），结果见图3、图4、表2、表3。从目水平来看，HT患者的梭菌目Clostridiales相对丰度较健康对照组偏低，HT肝郁脾虚组高于HT非肝郁脾虚组；
HT患者的拟杆菌目Bacteroidales相对丰度较健康对照组偏高，而HT肝郁脾虚组低于HT非肝郁脾虚组。从属水平来看，3组拟杆菌属Bacteroides相对丰度差异不大；
HT肝郁脾虚组栖粪杆菌属Faecalibacterium相对丰度低于HT非肝郁脾虚组和健康对照组；
HT患者普氏菌属Prevotella相对丰度明显高于健康对照组。
图3 3组受试者肠道菌群目水平分布
图4 3组受试者肠道菌群属水平分布
表2 3组受试者肠道菌群目水平相对丰度（前10位，%）
表3 3组受试者肠道菌群属水平相对丰度（前10位，%）
肠道菌群是人体内复杂的微生物生态系统，种类及数量庞大，与人类共生，其基因组有人类“第二基因组”之称[11]。近年来，肠道菌群失调与疾病关系越来越受到国内外研究者的重视。HT是自身免疫性疾病的一种，有研究报道，肠道菌群通过甲状腺-肠轴参与HT发生发展并改变甲状腺功能[12]。肠道菌群受年龄、BMI等因素影响，因此本研究根据HT患者基本情况匹配健康志愿者以减少偏倚。
本研究结果表明，HT肝郁脾虚证患者肠道菌群物种相对丰度发生改变，并且与HT非肝郁脾虚证患者肠道菌群物种丰度也有一定差异，提示HT患者肠道菌群改变与证候有一定关系。但本研究HT肝郁脾虚组部分患者兼有血瘀、气虚等证，HT非肝郁脾虚组包含肝郁化火、脾肾阳虚、肝郁气滞、脾肾气虚等证型，这可能对HT肝郁脾虚组和HT非肝郁脾虚组肠道菌群差异性分析造成影响。
本研究结果显示，健康人群拟杆菌目相对丰度低于HT肝郁脾虚证患者及非肝郁脾虚证患者，这与既往研究发现甲状腺功能减退型HT患者肠道拟杆菌门数量显著多于甲状腺功能正常型HT患者一致[13]。研究发现，拟杆菌目可以促进结肠中上皮内淋巴细胞数目增加，进而以髓样分化因子88依赖的方式产生白细胞介素-6（IL-6）[14]，IL-6参与HT免疫紊乱，与Th1/Th2比例失衡相关[15]，提示拟杆菌目丰度增高可能是HT转归的危险因素。此外，HT肝郁脾虚证多见于疾病早中期，后期多为脾肾阳虚证，脾运化功能失常可引起肠道微生态系统失去自稳状态，使肠道菌群失调，从而通过免疫相关机制对甲状腺产生影响，还可影响与HT相关的碘、硒等微量元素的代谢吸收。因此，这一研究结果还提示肠道菌群物种分布和丰度可能与HT疾病存在相关性。
本研究还发现，HT患者普氏菌属相对丰度明显高于健康人群。有研究显示，普氏菌属丰度较高的女性表现较高水平的负面情绪，如焦虑、苦恼和敏感性等[16]，而情志不畅与HT关系密切，HT患者伴随焦虑、抑郁状态的发病率远高于一般人群[17]，所以普氏菌属可能与HT相关。但也有研究认为，普氏菌属部分成员的丰度与Th17呈负相关，并可抑制促炎因子水平[18-19]，而国内外研究多认为Th17/Treg比例失衡是HT发生、发展的重要原因[20-21]，所以普氏菌属的部分成员还可能是HT发病的保护因素。HT患者肠道菌群普氏菌属的多样性和丰富度与HT的相关性还有待进一步研究。
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